Hoe werkt recombinant-DNA-technologie? Het bestudeerde organisme, dat zal worden gebruikt om DNA af te staan voor de analyse, wordt het donororganisme genoemd. De basisprocedure bestaat erin het DNA van een donorgenoom te extraheren en op te knippen in fragmenten die één tot verschillende genen bevatten, en deze fragmenten zichzelf afzonderlijk te laten opnemen in openstaande kleine autonoom replicerende DNA-moleculen, zoals bacteriële plasmiden. Deze kleine cirkelvormige moleculen fungeren als dragers, of vectoren, voor de DNA-fragmenten. De vectormoleculen met hun inserts worden recombinant DNA genoemd omdat zij bestaan uit nieuwe combinaties van DNA van het donorgenoom (dat van om het even welk organisme afkomstig kan zijn) met vector-DNA van een geheel andere bron (in het algemeen een bacterieel plasmide of een virus). Het recombinant-DNA-mengsel wordt vervolgens gebruikt om bacteriecellen te transformeren, en het komt vaak voor dat afzonderlijke recombinantvectormoleculen in afzonderlijke bacteriecellen terechtkomen. Bacteriële cellen worden uitgezet en krijgen de gelegenheid tot kolonies uit te groeien. Een individuele getransformeerde cel met een enkele recombinante vector zal zich delen in een kolonie met miljoenen cellen, die alle dezelfde recombinante vector dragen. Daarom bevat een individuele kolonie een zeer grote populatie van identieke DNA-inserts, en deze populatie wordt een DNA-kloon genoemd. Een groot deel van de analyse van het gekloonde DNA-fragment kan worden uitgevoerd in het stadium waarin het zich in de bacteriële gastheer bevindt. Later is het echter vaak wenselijk het gekloonde DNA weer in cellen van het oorspronkelijke donororganisme in te brengen om specifieke manipulaties van de genoomstructuur en de genfunctie uit te voeren. Het protocol ziet er dan ook vaak als volgt uit:
Boodschap
Klonen maakt de amplificatie en recuperatie mogelijk van een specifiek DNA-segment uit een groot, complex DNA-monster, zoals een genoom.
Omdat het donor-DNA in veel verschillende fragmenten is geknipt, zullen de meeste kolonies een verschillend recombinant DNA dragen (d.w.z. een verschillend gekloond insert). Daarom is de volgende stap een manier te vinden om de kloon te selecteren met het insert dat het specifieke gen bevat waarin wij geïnteresseerd zijn. Wanneer deze kloon is verkregen, wordt het DNA in bulk geïsoleerd en kan het gekloonde gen van belang worden onderworpen aan verschillende analyses, die later in het hoofdstuk aan de orde zullen komen. Merk op dat de kloonmethode werkt omdat afzonderlijke recombinant-DNA-moleculen in afzonderlijke bacteriële gastheercellen terechtkomen, en deze cellen vervolgens het werk doen van de amplificatie van de afzonderlijke moleculen tot grote populaties moleculen die als chemische reagentia kunnen worden behandeld. Figuur 12-1 geeft een algemeen overzicht van de aanpak.
Figuur 12-1
Recombinant-DNA-technologie maakt het mogelijk afzonderlijke DNA-fragmenten van om het even welk genoom in vector-DNA-moleculen, zoals plasmiden, in te brengen en afzonderlijk in bacteriën te versterken. Elk geamplificeerd fragment wordt een DNA-kloon genoemd.
De term recombinant DNA moet worden onderscheiden van de natuurlijke DNA-recombinanten die het resultaat zijn van crossing-over tussen homologe chromosomen in botheukaryoten en prokaryoten. Recombinant-DNA in de betekenis die in dit hoofdstuk wordt gebruikt, is een onnatuurlijke vereniging van DNA’s van niethomologe bronnen, gewoonlijk van verschillende organismen. Sommige genetici geven de voorkeur aan de alternatieve naam chimeer DNA, naar het mythologische Griekse monster Chimera. Door de eeuwen heen heeft de Chimera gestaan als symbool van een onmogelijke biologische unie, een combinatie van delen van verschillende dieren. Ook recombinant-DNA is een DNA-chimaera en zou onmogelijk zijn zonder de experimentele manipulatie die we recombinant-DNA-technologie noemen.
DNA isoleren
De eerste stap bij het maken van recombinant-DNA is het isoleren van donor- en vector-DNA.Algemene protocollen voor DNA-isolatie waren al vele tientallen jaren voor de uitvinding van recombinant-DNA-technologie beschikbaar. Bij het gebruik van dergelijke methoden zal het grootste deel van het DNA dat uit de donor wordt geëxtraheerd kerngenoom-DNA zijn bij eukaryoten of kerngenoom-DNA bij prokaryoten; deze types zijn in het algemeen degene die voor de analyse nodig zijn. De procedure voor het verkrijgen van vector-DNA hangt af van de aard van de vector. Bacteriële plasmiden zijn vaak gebruikte vectoren en deze plasmiden moeten worden gezuiverd van het bacteriële genomische DNA. Een protocol voor het extraheren van plasmide-DNA door middel van ultracentrifugering is samengevat in figuur 12-2. Plasmide-DNA vormt een afzonderlijke band naultracentrifugatie in een cesiumchloridedichtheidsgradiënt met ethidiumbromide. De plasmideband wordt opgevangen door een gaatje in het plastic centrifugeerbuisje te prikken. Een ander protocol berust op de waarneming dat bacterieel genomisch DNA bij een bepaalde alkalische pH denatureert, maar plasmiden niet. Bij daaropvolgende neutralisatie wordt het genomisch DNA neergeslagen, maar blijven de plasmiden in oplossing.Fagen zoals λ kunnen ook worden gebruikt als vectoren voor het kloneren van DNA in bacteriële systemen. Faag-DNA wordt geïsoleerd uit een zuivere suspensie van fagen die zijn teruggewonnen uit een lysaat van afweerstoffen.
Figuur 12-2
Plasmiden zoals die welke genen bevatten voor resistentie tegen het antibioticum tetracycline (linksboven) kunnen worden gescheiden van het bacteriële chromosomale DNA. Doordat de twee DNA-soorten zich verschillend binden aan ethidiumbromide, wordt het cirkelvormige plasmideDNA (meer…)
Snijden van DNA
De doorbraak die recombinant-DNA-technologie mogelijk maakte, was de ontdekking en karakterisering van restrictie-enzymen. Beperkingsenzymen worden door bacteriën geproduceerd als een verdedigingsmechanisme tegen fagen. De enzymen werken als een schaar, knippen het DNA van de faag door en inactiveren deze. Belangrijk is dat restrictie-enzymen niet willekeurig knippen, maar specifieke DNA doelsequenties doorknippen, wat een van de belangrijkste eigenschappen is die hen geschikt maken voor DNA manipulatie. Elke DNA-molecule, van virus tot mens, bevat puur toevallig doelsequenties van restrictie-enzymen en kan derhalve in welbepaalde fragmenten van een voor klonen geschikte grootte worden geknipt. Restrictieplaatsen zijn niet relevant voor de functie van het organisme, en ze zouden niet in vivo worden doorgesneden, omdat de meeste organismen geen restrictie-enzymen hebben.
Laten we eens naar een voorbeeld kijken: het restrictie-enzym EcoRI (uitE. coli) herkent de volgende zes-nucleotide-paarsequentie in het DNA van een willekeurig organisme:
Dit type segment wordt een DNA-palindroom genoemd, wat betekent dat beide strengen dezelfde nucleotidesequentie hebben, maar in antiparallelle oriëntatie.Veel verschillende restrictie-enzymen herkennen en knippen specifieke palindromen door. Het enzym EcoRI snijdt binnen deze sequentie, maar in een paar gestaggerde sneden tussen de G en de A nucleotiden.
Deze gestaggerde snede laat een paar identieke enkelstrengs “kleverige uiteinden” achter. De uiteinden worden kleverig genoemd omdat ze een waterstofbrug kunnen vormen (kleven) aan een complementaire sequentie. Figuur 12-3 toont EcoRI die een enkele snede maakt in een cirkelvormig DNA-molecuul zoals een plasmide: de snede opent de cirkel, en het lineaire molecuul dat wordt gevormd heeft twee kleverige uiteinden. De productie van deze kleverige uiteinden is een andere eigenschap van beperkingsenzymen die hen geschikt maakt voor recombinant-DNA-technologie. Het principe is eenvoudigweg dat, als twee verschillende DNA-moleculen met hetzelfdeerestrictie-enzym worden doorgesneden, beide fragmenten met dezelfde complementaire kleverige uiteinden zullen produceren, waardoor het mogelijk wordt DNA-chimaeren te vormen. Als dus zowel vector-DNA als donor-DNA met EcoRI worden doorgesneden, kunnen de kleverige uiteinden van de vector zich binden aan de kleverige uiteinden van een donorfragment als de twee worden gemengd.
Figuur 12-3
Het restrictie-enzym EcoRI knipt een cirkelvormig DNA-molecuul met één doelsequentie door, resulterend in een lineair molecuul met enkelstrengs kleverige uiteinden.
Boodschap
Restrictie-enzymen hebben twee eigenschappen die nuttig zijn bij recombinant-DNA-technologie.Ten eerste knippen ze DNA in fragmenten van een zodanige grootte dat ze geschikt zijn voor klonering. Ten tweede maken veel restrictie-enzymen verspringende sneden die single-stranded sticky ends creëren die bevorderlijk zijn voor de vorming van recombinant DNA.
Tientallen restrictie-enzymen met verschillende sequentiespecificiteiten zijn nu geïdentificeerd, waarvan er enkele in tabel 12-1 zijn weergegeven. U zult zien dat alle doelsequenties palindromen zijn, maar, zoals EcoRI, sommige enzymen maken verspringende sneden, terwijl andere gelijkmatige sneden maken. Zelfs “flush cuts”, die geen kleverige uiteinden hebben, kunnen worden gebruikt voor het maken van recombinant DNA.
Tabel 12-1
Recognition, Cleavage, and Modification Sites of Various RestrictionEnzymes.
DNA kan ook worden gesneden door het mechanisch af te schuiven. Door DNA bijvoorbeeld in een mixer te schudden, worden de lange moleculen ter grootte van een chromosoom opgesplitst in segmenten die aan elkaar kunnen worden geplakt.
DNA aan elkaar koppelen
Het meest gebruikelijk is dat zowel donor-DNA als vector-DNA worden verteerd met behulp van een restrictie-enzym dat kleverige uiteinden produceert, en vervolgens in een reageerbuis worden gemengd zodat de kleverige uiteinden van vector- en donor-DNA zich aan elkaar kunnen binden enrecombinante moleculen kunnen vormen. In figuur 12-4 is een plasmide-vector te zien die een enkele EcoRI-restrictiesite bevat; door ontsluiting met het restrictie-enzym EcoRI wordt het cirkelvormige DNA omgezet in een lineair molecuul met kleverige uiteinden. Donor-DNA van een andere bron (zeg, Drosophila) wordt ook behandeld met het EcoRI-enzym om een populatie fragmenten met dezelfde kleverige uiteinden te produceren. Wanneer de twee populaties worden gemengd, kunnen DNA-fragmenten van de twee bronnen zich verenigen, omdat zich dubbele schroeflijnen vormen tussen hun kleverige uiteinden. Er zijn veel geopende vectormoleculen in de oplossing, en veel verschillendeEcoRI -fragmenten van donor-DNA. Daarom zal een diverse reeks van vectoren met verschillende donorinserts worden geproduceerd. In dit stadium, hoewel de kleverige einden zich hebben verenigd om een bevolking van chimere molecules te produceren, zijn de suiker-fosfaat backbones nog niet volledig op twee posities bij elke verbinding. De ruggengraten kunnen echter worden verzegeld door toevoeging van het enzym DNA-ligase, dat fosfodiësterbindingen op de knooppunten creëert (figuur 12-4b). Bepaalde ligasen zijn zelfs in staat DNA-fragmenten met stompe uiteinden te verbinden.
Figuur 12-4
Methode voor het genereren van een chimeer DNA-plasmide dat van vreemd DNA afgeleide genen bevat. (Uit S.N. Cohen, “The Manipulation of Genes.” Auteursrecht © 1975 door Scientific American, Inc. All rightsreserved.)
Het vermenigvuldigen van recombinant-DNA
Het geligeerde recombinant-DNA komt door transformatie in een bacteriële cel terecht. Nadat het in de gastheercel is, kan de plasmidevector zich vermenigvuldigen omdat plasmiden normaal gesproken een replicatieoorsprong hebben. Nu het donor-DNA-insert echter deel uitmaakt van de lengte van de vector, wordt het donor-DNA automatisch samen met de vector gerepliceerd. Elk recombinant plasmide dat in een cel terechtkomt, vormt in die cel meerdere kopieën van zichzelf. Vervolgens zullen vele cycli van celdeling plaatsvinden, en de recombinante vectoren zullen meer replicatierondes ondergaan. De resulterende kolonie bacteriën zal miljarden kopieën van het singledonor-DNA-insert bevatten. Deze verzameling van geamplificeerde kopieën van het enkele donor-DNA-fragment is de DNA-kloon (figuur 12-5).
Figuur 12-5
Hoe amplificatie werkt. Behandeling van donor-DNA en vector met restrictie-enzymen maakt invoeging van afzonderlijke fragmenten in vectoren mogelijk. Een enkele vector komt in een bacteriële gastheer terecht, waar replicatie en celdeling resulteren in een groot aantal kopieën van het donorfragment. (meer…)