Een onderzoek naar de impact van anticentromeer antilichamen op embryo’s in een vroeg stadium

Abstract

Achtergronden. Eerder vonden we bij vrouwen met een positief anticentromeer antilichaam een verminderd potentieel van oöcyt rijping en embryo splitsing; het mogelijke mechanisme achter dit fenomeen was nog onbekend. Doelstelling. Het doel van de huidige studie was om vooraf te onderzoeken of ACA kan doordringen tot levende embryo’s en hun ontwikkelingspotentieel kan aantasten via in vitro cocultuur met muisembryo’s. Methoden. Muisembryo’s werden verzameld en gebruikt voor in vitro cultuur met polyklonaal anticentromeer proteïne A (CENP-A) antilichaam; vervolgens werd immunofluorescentie-assay uitgevoerd om de penetratie van antilichaam in embryo’s te bepalen, en het ontwikkelingspotentieel van embryo’s werd geobserveerd. Resultaten. Alle embryo’s die gekweekt werden met anti-CENP-A antilichaam vertoonden immunofluorescentie op de celkern, terwijl geen van de embryo’s uit de controlegroepen immunofluorescentie vertoonde. Bovendien vertoonden de embryo’s die gekweekt waren met anti-CENP-A antilichaam een significante groeivertraging vergeleken met de controlegroepen. Conclusie. Muisembryo’s kunnen een direct doelwit zijn voor ACA in vitro voorafgaand aan de implantatie. Het precieze mechanisme moet echter nog verder worden opgehelderd.

1. Inleiding

Een recente studie toonde stoornissen aan in de rijping van eicellen en de vroege embryonale ontwikkeling bij vrouwen met een positief anticentromeer antilichaam (ACA) in hun perifere bloed. Meer recent vonden we dat vrouwen die positief waren voor ACA een significant lager percentage rijpe oöcyten en een lager percentage gespleten embryo’s hadden in vergelijking met vrouwen die negatief waren voor ACA , wat de potentiële impact van ACA op de vrouwelijke vruchtbaarheid verder aantoont. ACA is bekend als een van de leden van de ANA’s. Het werd voor het eerst ontdekt in 1980 als een specifiek antilichaam tegen centromeer in serum van patiënten met calcinose, het fenomeen van Raynaud, slokdarmdysmotiliteit, sclerodactylie, en telangiectasie (CREST) syndroom. Nu is ACA erkend als een effectieve aanvullende diagnostische marker voor systemische sclerose (SSc). Zoals gerapporteerd, zijn vrouwelijke patiënten met SSc vatbaar voor verschillende nadelige zwangerschapsuitkomsten, waaronder een verhoogd spontaan abortuscijfer, vroeggeboorte, kleine baby’s en onvruchtbaarheid. Bovendien, de onvruchtbaarheid prevalentie bij patiënten met SSc is hoog, en het succespercentage voor onvruchtbaarheidsbehandeling is relatief laag, wat nader onderzoek vereist.

Al in de jaren 1990, probeerden onderzoekers ACA te micro-injecteren in muizeneieren, wat leidde tot stoornissen van chromosomale beweging en segregatie . Het is bekend dat kinetochore de aanhechtingsplaats is van spindel microtubules in de centromerische regio van een chromosoom . Ook is het de dynamische structuur voor mitose, meiose, en andere belangrijke activiteiten van cellen . Daarom zou het redelijk zijn om af te leiden dat ACA zou kunnen interfereren met meiose of mitose in levende cellen.

Centromeer is een DNA-eiwit complex, en de assemblage ervan wordt gecoreguleerd door centromerische chromatines en hun geassocieerde eiwitcomplex . Centromeer proteïne A (CENP-A) is een van de constitutieve centromeer eiwitten met relatief duidelijke biologische functies die het meest is bestudeerd; zijn belangrijke rol in de assemblage en functionele uitvoering van centromeer is herhaaldelijk geverifieerd . Bovendien wordt CENP-A, net als CENP-B, beschouwd als een belangrijk doelwit-antigeen van ACA.

Het werd gespeculeerd dat ACA één van de ANAs zou kunnen zijn die het meest geassocieerd is met abnormale oocyte-rijping en embryo-kloven. Het doel van deze studie was dan ook om de mogelijke invloed van ACA op embryo’s in een vroeg stadium te onderzoeken via in vitro cocultuur met muisembryo’s.

2. Materialen en Methoden

2.1. Muisembryo’s

Superovulatie werd geïnduceerd in raskleurige ICR muizen door stimulatie met drachtig merrieserum gonadotrofine (10 IE intraperitoneaal (i.p.)) en humaan choriongonadotrofine (10 IE i.p. na 48 uur) en gepaard met ICR mannetjes. De vrouwelijke muizen werden 24 uur na de paring gedood. Vroeg-stadium embryo’s werden verzameld door scherpe dissectie van de eileiders en gebruikt in de experimenten. De Ethische Commissie van het Eerste Affiliated Ziekenhuis van de Sun Yat-Sen Universiteit keurde deze studie goed.

2.2. In Vitro Embryo Cultuur

De embryo’s werden gekweekt in het seriële medium van Quinn (Sage, USA). Voor de antilichaamgroep werd konijn-polyklonaal antilichaam tegen muis-CENP-A (boviene serumalbumine- en azidevrij, aangepaste producten van Abcam, Verenigd Koninkrijk) aan het medium toegevoegd. De antilichaam concentratie in het medium was 35 ug / ml (gewijzigd op basis van de literatuur ). Voor de fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) groep (diende als controle), werd de PBS-oplossing (PBS tablet, Millipore, Merck, Duitsland) met hetzelfde volume als de antilichaamoplossing toegevoegd aan het medium. De blanco controlegroep bestond uit het medium zonder enige toevoegingen.

2.3.

Op de tweede en derde dag van de kweek werden drie tot vijf embryo’s uit elk schaaltje van de drie groepen geplukt voor de immunofluorescentietest, om na te gaan of de signalen van anti-CENP-A-antilichaam in de embryo’s aanwezig waren na de cocultuur. De procedures voor de immunofluorescentiebepaling waren als volgt: De embryo’s werden gefixeerd in 4% polyoxymethyleen en vervolgens doordrenkt met 0,5% Triton X-100 (Sigma, USA), gevolgd door verzegeling in 5% normaal ezelserum (Jackson Immunoresearch, USA). Daarna werden de embryo’s geïncubeerd gedurende 1 uur met 488-gelabelde donkey antirabbit IgG (Invitrogen, UK, 1 : 1000 verdunning), gespoeld, geïncubeerd met 1 ug / mL DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindool, dihydrochloride, Cell Signaling Technology, USA) gedurende 15 min, opnieuw gespoeld, en gefixeerd in een schaal voor latere microscopische observatie. Om vals-positief van de experimentele groep uit te sluiten, werden embryo’s van antilichamen groep geïncubeerd met PBS in plaats van 488-gelabelde ezel antirabbit IgG (antilichamen groep voor controle).

2.4.

2.4. Ontwikkeling van gecultiveerde embryo’s (Embryotoxiciteitstest)

Het verzamelen en cultiveren van de embryo’s voor deze embryotoxiciteitstest waren hetzelfde als eerder beschreven, behalve dat de embryo’s gedurende de gehele periode van 3 dagen in de schaaltjes bleven. De embryo’s in elke groep werden onderzocht om hun ontwikkelingsstadium te bepalen op de derde en vijfde dag (de eerste dag was de dag waarop de eicellen werden gewonnen). De volgende ontwikkelingsstadia werden geregistreerd: 6- tot 8-cellig stadium op de derde dag, en blastocyst, morula, 2- tot 8-cellig en atretisch stadium op de vijfde dag.

2.5. Statistische Analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met SPSS 13 (SPSS, IL, USA). Een chi-kwadraat toets en een partitie van chi-kwadraat toetsen werden gebruikt om de kwalitatieve gegevens te vergelijken. Een waarde kleiner dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant bij de chi-kwadraat toets tussen de drie groepen, en een waarde kleiner dan 0,0167 werd gebruikt om statistische significantie aan te geven bij de partitie van chi-kwadraat toetsen tussen groepen.

3. Resultaten

3.1. Immunofluorescentie

Alle embryo’s gekweekt met anti-CENP-A antilichaam vertoonden sterke immunofluorescentie in hun kernen, terwijl geen van de embryo’s uit de PBS- en blanco controlegroepen, evenals de antilichaamgroep voor controle, immunofluorescentie vertoonden (figuur 1).

Figuur 1

Immunofluorescentie-opnamen van embryo’s gekweekt met anti-CENP-A-antilichaam (oorspronkelijke vergroting ×400). Antilichaamfluorescentie was aanwezig op de kernen van blastomeren in embryo’s uit de antilichaamgroep, terwijl geen significante antilichaamfluorescentie werd waargenomen in de embryo’s uit de groepen PBS, blanco controle, en antilichaamgroep voor controle.

3.2.

Vergeleken met de PBS- en de blanco controlegroep waren de percentages embryo’s in het 6- tot 8-cellige stadium op de derde dag, en de blastula- en morulastadiumembryo’s op de vijfde dag, significant lager in de antilichaamgroep. De ontwikkelingsmogelijkheden van de embryo’s waren vergelijkbaar tussen de PBS en blanco controlegroepen (Tabel 1).

4. Discussion

In 1999 ontdekten onderzoekers dat alle muizenembryo’s die gekweekt waren met gezuiverd antinucleair IgG sterke immunofluorescentie vertoonden op de embryonale cellen en een significante groeistoornis of sterfte vertoonden in vergelijking met embryo’s die gekweekt waren met controle-immunoglobulinen . Dit wees erop dat ANA’s zich rechtstreeks aan embryo’s in vitro konden binden. De precieze epitopen waren echter niet bekend omdat er geen kernantigenen of fosfolipiden in de zona werden aangetroffen. In muizenembryo’s in het 2-cellige stadium wordt een reeks nucleoproteïnen tijdelijk gesynthetiseerd en verandert de samenstelling van het embryonale chromatine, wat suggereert dat vroege embryo’s mogelijk epitopen voor ANA bezitten. Bovendien is de binding relatief specifiek, aangezien antityroïdantilichamen en antilichamen van gezonde personen geen aanwijzingen voor binding aan embryo’s vertonen. Micro-injectie van ACA-bevattend serum in muizenocyt zou de chromosoomcongruentie kunnen belemmeren en meiotische arrestatie in de interfase of mitotische arrestatie in de prometafase kunnen veroorzaken.

In de huidige studie vertoonden alle embryo’s die gekweekt waren met polyklonaal anti-CENP-A antilichaam sterke immunofluorescentie van antilichaam tegen nucleaire componenten (waarvan gespeculeerd werd dat het anti-CENP-A antilichaam was) en ervoeren ze een duidelijke embryonale groeistoornis, wat erop wijst dat muizenembryo’s een direct doelwit kunnen zijn voor sommige ACA’s in vitro voorafgaand aan de implantatie. Bovendien vertoonden bij de meerderheid van de gecocultiveerde embryo’s altijd slechts één of enkele van de blastomeren fluorescentie. Misschien verhindert de dichtheid van structuren in en rond het centromeer de toegankelijkheid van anti-CENP-A antilichamen, of was het blastomeer met waarneembare fluorescentie geneigd tot apoptose en vertoonde het relatief losse structuren die de toegankelijkheid van anti-CENP-A antilichamen mogelijk maakten. Het precieze mechanisme moet echter nog verder worden opgehelderd.

Hoewel er nog geen definitief concept bestaat voor antilichamen die de levende cellen binnendringen, en het betrokken mechanisme nog onbekend is, leverden deze studies bewijs voor antilichamen die de levende cellen binnendringen. Zo kon het anti-ribonucleoproteïne-IgG selectief de T-lymfocyten binnendringen, terwijl er relatief minder Fc-receptoren aanwezig waren op het oppervlak van T-lymfocyten. Dit suggereerde dat sommige andere mechanismen die relevant zijn voor niet-Fc regulatie betrokken zouden kunnen zijn, die geassocieerd zouden kunnen zijn met antigeen-achtige structuren op het lymfocyten oppervlak, wat impliceert dat de ribonucleoproteïne antilichamen interageerden met de ribonucleoproteïne antigenen op het celoppervlak om hun toegang tot de levende cellen te reguleren.

In deze studie werd ook vastgesteld dat het embryonale ontwikkelingspotentieel aanzienlijk was aangetast na kweek met anti-CENP-A antilichaam, met significant lagere percentages van 6- tot 8-celstadium embryo’s op de derde dag en blastula stadium embryo’s op de vijfde dag. Uit een eerdere studie is namelijk gebleken dat muizenembryo’s die gekweekt waren met gezuiverd IgG van ANA-positief serum een significant verminderd embryonaal ontwikkelingspotentieel vertoonden. ANA kan doordringen tot in subcellulaire structuren die overeenkomstige antigenen bevatten, waar het epitopen in de belangrijke functionele gebieden kan identificeren en zich eraan kan binden. Deze auto-antilichamen konden de functie van antigenen zowel in vivo als in vitro aanzienlijk remmen.

In conclusie, embryo’s gekweekt met anti-CENP-A antilichaam ondervonden aanzienlijke groeivermindering of dood. Aldus zouden embryo’s een direct doelwit kunnen zijn voor anti-CENP-A antilichaam.

Ethische goedkeuring

Medical Ethics Committee of The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University keurde de studie goed (nr. 75).

Conflicts of Interest

Ying Ying, Xi Guo, Yiping Zhong, and Canquan Zhou verklaren dat zij geen belangenconflict hebben.

Acknowledgments

Deze studie werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (nr. 81701518), Guangzhou Science and Technology and Information Bureau (nr. 2014J4100161), Science & Technology Project van de provincie Guangdong (nr. 2013B021800271), en Population and Family Planning Commission van de provincie Guangdong (nr. 20132048). Deze studie werd ondersteund door het Key Laboratory for Reproductive Medicine van de provincie Guangdong van The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. De studie werd ook ondersteund door twee belangrijke laboratoria van het derde geaffilieerde ziekenhuis van de Medische Universiteit van Guangzhou; dit waren het belangrijkste laboratorium voor belangrijke verloskundige ziekten van de provincie Guangdong en het belangrijkste laboratorium voor voortplanting en genetica van de instellingen voor hoger onderwijs van Guangdong.