Effecten van zijketens in helix nucleatie verschillen van helix voortplanting

Resultaten en Discussie

Onze benadering van helix nucleatie te beoordelen maakt gebruik van waterstofbrug surrogaat (HBS) α-helixen waarin de N-terminale main-keten waterstofbinding wordt vervangen door een covalente binding (Fig. 1B) (20). In eerdere rapporten hebben we beschreven HBS schroeflijnen waarin de waterstofbrug wordt vervangen door een koolstof-koolstofverbinding (21). Karakterisering van deze synthetische schroeflijnen door CD en 2D-NMR spectroscopie, evenals single crystal X-ray diffractie-analyse, blijkt dat ze getrouw de conformatie van canonieke α-helften (21, 22) na te bootsen. Belangrijk is dat HBS helices in staat zijn om intracellulaire eiwit-eiwit interacties gemedieerd door α-helicale domeinen te remmen, wat de hypothese ondersteunt dat deze verbindingen de structuur en functie van eiwit α-helixen reproduceren (23, 24). Om het effect van verschillende residuen op α-helixvorming te analyseren, hebben we een HBS-analoog bereid met een disulfidebinding waarvan de vormingssnelheid onder waterige omstandigheden kon worden gecontroleerd (25). Wij veronderstelden dat de snelheid van vorming van deze koppeling een unieke probe zou zijn voor het onderzoeken van biofysische parameters in verband met helixvorming. Omdat de disulfide-HBS (dsHBS) koppeling de intramoleculaire waterstofbrug in α-helixen nabootst, veronderstelden wij dat de bisthiol (bt) naar disulfide (ds) oxidatie een directe maat voor helixkernvorming zou opleveren (Fig. 1C). Snelheden van helixvorming voor modelpeptiden zijn gemeten door ultrasnelle spectroscopieën en vallen in de nanoseconde bereik (14, 26⇓⇓-29). De snelheid van disulfidevorming is veel lager (in de orde van minuten) onder onze reactieomstandigheden (30). De dramatisch langzamere tijdschaal voor disulfide vorming suggereert dat volgorde-afhankelijke verschillen in de snelheid van disulfide vorming weerspiegelen pre-evenwicht populaties: residuen met een hogere nucleating neiging gunst disulfide formatie.

Disulfide-gekoppelde HBS spiraaltjes kunnen worden afgeleid van oxidatie van de ouder bisthiol peptiden waardoor een gemakkelijke benadering van de conformatie van het peptide (31⇓⇓-34) te controleren. Ons eerste peptideontwerp was gebaseerd op een kort segment van het p53 activeringsdomein: XQEG*FSDLWKLLS (1), waarbij X en G* de dsHBS-beperkte residuen vertegenwoordigen (35). De p53-sequentie is gekozen omdat die relatief weinig zijketencontacten zoals ionische bruggen heeft, die de resultaten kunnen vertekenen. We hebben eerder gekarakteriseerd een aantal p53 HBS analogen door CD en NMR spectroscopieën waardoor we potentiële aggregatie problemen die gestabiliseerde constructen kunnen beïnvloeden voorspellen (36⇓-38). De bisthiol p53 peptide is zwak spiraalvormig in waterige buffers bij 295 K. CD spectroscopie (Fig. 2A) blijkt dat de p53 dsHBS 1 is zeer spiraalvormig in vergelijking met de ouder bt-peptide (25). Wij selecteerden A, G, D, I, K, L, P, en V als de gastresiduen voor dit onderzoek. Deze selectie omvat representatieve alifatische rechte keten en β-vertakte residuen samen met positief en negatief geladen zijketens.

Na de eerste experimenten, peptide 1 werd gewijzigd door het vervangen van de natieve glutaminezuur en fenylalanine residuen met lysine en alanine, respectievelijk, tot 2Λ te verkrijgen: XΛKG*ASDLWKLLS. De nieuwe sequentie is ontworpen om mogelijke zij-keteninteracties tussen de gastresiduen (Λ) en de overeenkomstige i+3-positie te vermijden; lysine is toegevoegd om de oplosbaarheid van de gastheer in water te vergroten. De tweede positie werd gekozen voor de introductie van gasten omdat de conformatie van dit residu betrokken is bij helix inductie nabij de N terminus (39, 40). De spiraalconformatie van ds-2A: XAKG * ASDLWKLLS werd beoordeeld met behulp van een combinatie van 1D NMR, totaal correlatie spectroscopie, en roterende-frame nucleaire Overhauser effect correlatie spectroscopie (ROESY) studies in waterige oplossingen (SI tekst, tabel S1, en Fig. S1). De ROESY spectra onthuld nucleaire Overhauser effect (NOE) cross-pieken indicatief voor een spiraalvormige structuur, met inbegrip van opeenvolgende NH-NH (i en i + 1) en een aantal langere range NOEs (tussen i en i + 3 / i + 4) (SI Text, Tabel S2). Belangrijk is dat alle ϕ-dihedraalhoeken van de ruggengraat, berekend uit de 3JNHCHα-koppelconstanten, in het verwachte bereik liggen voor spiraalconformatie (SI-Tekst, Tabel S1) (41, 42). De waargenomen koppelingsconstanten voor de residuen binnen de macrocyclus verschillen niet van de rest van de keten, wat aangeeft dat de disulfide beperking een getrouwe inductie van een α-helicale conformatie oplevert. De oplossing structuur van ds-2A werd bepaald uit 48 ROESY cross-peaks en 11 berekende ϕ hoeken met behulp van Monte Carlo conformational search in Macromodel 2014. Een overlay van de 20 structuren met de laagste energie voor ds-2A wordt getoond in Fig. 2B. Opmerkelijk is dat de disulfide-beperkte macrocyclus de N-terminus van de α-helix niet verstoort. Over het geheel genomen, samen met CD spectroscopie, de NMR-studies bevestigen stabilisatie van een belangrijke α-helix conformatie in dsHBS-beperkte peptiden.

De bisthiol en HBS peptiden werden gesynthetiseerd zoals getoond in SI Text, Fig. S2. We gebruikten milde oxidatie omstandigheden bestaande uit 2% (vol / vol) DMSO om de bisthiolen oxideren (Fig. 2C) (25, 30). Om de nauw verwante bisthiol en dsHBS peptiden op HPLC te scheiden en de thiolgroepen te doven, behandelden we het reactiemengsel met een maleïmide derivaat (43). Adequate scheiding van de bisthiol en disulfide peptiden op HPLC konden we de tarieven van disulfide vorming voor elke sequentie kwantificeren uit de analyse van HPLC piekgebieden (Fig. 3A en Fig. S3). De eerste tarieven van disulfide vorming zijn uitgezet in Fig. 3B, en de getabelleerde gegevens worden gepresenteerd in tabel 1.

We vinden dat de nucleatie propensity van alanine sterker is dan die van glycine, terwijl de vorming van disulfidebindingen met proline als gast te langzaam is om nauwkeurig te meten. Deze resultaten komen overeen met bekende verbanden: glycine is een zeer flexibel residu, terwijl proline alleen als N-cap residu de heliciteit bevordert en niet op andere posities in de helix. Deze resultaten geven ook aan dat conformatie van de macrocyclus van invloed is op de snelheid van de disulfidevorming. Als de snelheid van de binding onafhankelijk zou zijn van de conformatie van de macrocyclus, zou substitutie van een enkel glycine in plaats van een alanine geen significant effect hebben. Het is waarschijnlijk dat de peptideketen voorbij de vermeende macrocyclus de preequilibrium-conformatie beïnvloedt, maar omdat het bisthiol-peptide grotendeels niet-α-helisch is, verwachten we dat dit effect subtiel is en voor elke mutant gelijk.

Leucine en alanine sequenties zijn vergelijkbaar in hun disulfide-vormingssnelheden, zoals kan worden verwacht uit de literatuur neiging waarden (tabel 1) (6). Deze resultaten bieden nuttige meetmethoden om het potentieel van ons synthetische model te meten als een probe van helix nucleatie. Verrassend genoeg blijkt uit ons onderzoek dat β-vertakte residuen niet nadelig zijn voor α-helixkernvorming. Inderdaad, de snelheid van de disulfide vorming met valine is bijna gelijk aan die van alanine en leucine, terwijl isoleucine tot een lichte afname leidt. Geladen residuen, lysine en aspartaat, vertragen de reactiesnelheid tot het niveau van glycine. Omdat asparaginezuur een bekende helixbreker is, terwijl lysine beschouwd wordt als een helixstabiliserend residu (44, 45), suggereren deze resultaten dat geladen residuen mogelijk deelnemen aan lange-afstand interacties. Hoewel de sequenties van deze studie werden ontworpen om de context afhankelijkheid te minimaliseren, kunnen ruggengraat interacties niet volledig worden uitgesloten. CD spectroscopie toont aan dat vijf van de acht dsHBS sequenties zeer vergelijkbaar spiraalvormige inhoud hebben; substitutie van glycine, proline, en asparaginezuur verlaagt de heliciteit (Fig. 3C). We vermoeden dat spiraalvormige stabiliteit van de beperkte sequentie is niet een belangrijke determinant van de vorming van disulfide snelheid. Vergelijking van de lysine en asparaginezuur sequenties biedt ondersteuning voor deze hypothese, omdat deze sequenties vertonen vergelijkbare tarieven van disulfide vorming, terwijl de beperkte peptiden vertonen verschillende spiraalvormige stabiliteit. Geladen residuen aan het einde van schroeflijnen kunnen positief of negatief helix stabiliteit beïnvloeden op basis van hun interacties met de helix macrodipool (46). Dergelijke macrodipolaire interacties mogen echter niet van invloed op het proces van helix nucleatie, omdat de helix is nog niet georganiseerd.

Om theoretische ondersteuning voor onze experimentele waarnemingen te verkrijgen, berekenden we activeringsbarrières voor de vorming van een i tot i + 4 waterstofbrug in peptide sequenties met behulp van metadynamics simulaties (47, 48). Helix-coil overgangen zijn eerder onderzocht met behulp van moleculair-dynamische simulaties om helix neiging en nucleatie tijdschalen te analyseren, maar, voor zover wij weten, is het effect van puntmutaties op helix nucleatie niet systematisch onderzocht (28, 39, 49). We hebben het effect van verschillende residuen op de vorming van een α-bocht bepaald in een geacetyleerde en gemethyleerde modelpeptidesequentie, Ac-AΛA-NHMe. We gebruikten Schrodinger’s 2012 verdeling van Desmond 3.1 (50) om 50-ns metadynamics simulatie uit te voeren op de tripeptide met behulp van het Amber krachtveld ff12SB en bijbehorende monovalente ion parameters (51, 52). Twee-dimensionale vrije-energie oppervlakken werden bepaald en activeringsenergieën werden geïdentificeerd door inspectie (Fig. 4). De activeringsenergieën stabiliseren als simulatielengte toeneemt, wat suggereert dat de simulatie convergeerde bij 15 ns (Fig. S4). We hebben de simulaties ook in drievoud uitgevoerd en de gemiddelde rmsd tussen de resulterende vrije-energie oppervlakken gemeten (Fig. S4). Analyse toont aan dat alle gast (Λ) residuen, behalve proline, dihedraalhoeken bemonsteren die overeenkomen met links- en rechtshandige α-helix, β-streng, en polyproline II (PPII) regio’s van de Ramachandran plot (Fig. 4A). De plot van het prolinebevattende tripeptide vertoont alleen de α- en PPII-minima (fig. 4B). De grafieken voor de overige 18 gastresiduen in Ac-AΛA-NHMe zijn weergegeven in Fig. S5. De gewogen fractie van α-, β- en PPII-populaties voor verschillende gastresiduen is uitgezet in Fig. 4C. Om de barrière voor helixvorming te berekenen, vergeleken we voor elk residu de hoogte van de kortste piek tussen het laagste energiebekken dat overeenkomt met de PPII- of β-dihedralhoeken met de α-helicale dihedral (Fig. 4D). De PPII dihedral hoeken bleken de laagste energieconformatie te zijn voor de meeste gastresiduen in onze berekeningen.

De resultaten van deze berekeningen komen overeen met de experimentele gegevens en suggereren dat de barrière voor pre-organisatie van de α-helicale conformatie niet de neiging schalen volgt. Hoewel de activeringsenergieën de startpopulaties en energieprofielen van de α- en β- of PPII-conformatie weerspiegelen, bieden ze een maat voor het schatten van de residu-afhankelijke moeilijkheid van het aannemen van een α-helicale conformatie. De berekende ∆G‡ waarden identificeren gastresidu’s met snelle en langzame vouwsnelheden, maar suggereren dat de snelheden van verscheidene anderen niet gemakkelijk te onderscheiden zijn. Over het algemeen ondersteunen de berekeningen de experimentele waarnemingen dat helische neiging schalen niet van toepassing zijn op helix nucleatie.