Mesofylporositeit wordt gemoduleerd door de aanwezigheid van functionele huidmondjes

De stomatale grootte en dichtheid van tarwe verandert met ploïdie

Om te onderzoeken of de stomatale kenmerken variëren met het ploïdie-niveau in tarwe, onderzochten we de grootte en het patroon van de huidmondjes in twee diploïde (2n) soorten (Triticum baeoticum en T. urartu), twee tetraploïde (4n) soorten (T. araraticum, T. dicoccoides) en drie cultivars van de hexaploïde (6n) T. aestivum (cv. Cougar, Crusoe en Shango). De tarwesoorten vertonen karakteristieke huidmondjes van grassen, waarbij de huidmondjescomplexen (elk bestaande uit een paar bewakingscellen geflankeerd door secundaire cellen) in epidermale celvijlen langs het bladoppervlak liggen. Voorbeeldbeelden van de algemene verdeling van de huidmondjes in de verschillende ploïdie-achtergronden worden getoond in Fig. 1a-c, met hogeresolutiebeelden van individuele huidmondjescomplexen getoond in Fig. 1d-f. Deze beelden suggereren dat de grootte en dichtheid van de huidmondjes wordt beïnvloed door de ploïdie in tarwe. Meting van deze parameters gevolgd door statistische analyse (ANOVA met posthoc Tukey) toonde aan dat de huidmondjescomplexen van de hexaploïde cultivars breder waren dan die van zowel tetraploïde (P < 0.001) en diploïde soorten (P < 0.001), die zelf niet van elkaar te onderscheiden waren (P = 0.115; Fig. 1g). Daarentegen was de lengte van de huidmondjescomplexen niet te onderscheiden tussen tetraploïde en hexaploïde lijnen (ANOVA met posthoc Tukey, P = 0.479), terwijl de huidmondjes bij de diploïde tarwe significant korter waren dan bij zowel de tetraploïde (P < 0.001) als de hexaploïde lijnen (P < 0.001; Fig. 1i). Dus, omdat stomatale complex gebied is afhankelijk van zowel de lengte en breedte van de huidmondjes, de stapsgewijze verschillen in deze parameters tussen de drie ploïdie achtergronden leidt tot huidmondjes grootte verschillend zijn op elk ploïdie niveau (ANOVA met posthoc Tukey, diploïde / tetraploïde P < 0.001; tetraploïd/hexaploïd P < 0.001). De huidmondjescomplexen waren het kleinst bij de diploïde soorten, het grootst bij de hexaploïde cultivars, en gemiddeld bij de tetraploïde soorten (Fig. 1h). De stapsgewijze toename van de lengte van de huidmondjescomplexen in Fig. 1i werd weerspiegeld door de dichtheid van de huidmondjes (Fig. 1j), waarbij de diploïde soorten een duidelijk hogere dichtheid hadden dan de tetraploïde (ANOVA met posthoc Tukey, P < 0.001) en hexaploïde soorten (P < 0.001) (die niet van elkaar konden worden onderscheiden op basis van de huidmondjesdichtheid; P = 0.616). Onze gegevens suggereren dat er een indirecte selectie is geweest voor bladeren met grotere maar relatief minder huidmondjes gedurende de complexe domesticatie van moderne hexaploïde tarwe. Dit lijkt stapsgewijs te zijn gebeurd, zodat tetraploïden zich van diploïden onderscheiden door langere, minder dichte huidmondjes van gelijke breedte, en de hexaploïde moderne broodtarwecultivars bredere huidmondjescomplexen hebben dan hun tetraploïde wilde verwanten, hetgeen waarschijnlijk is opgetreden na of gelijktijdig met de fusie van de diploïde en tetraploïde voorlopers.

Mesofylluchtruimte en huidmondjespatroon zijn gecoördineerd

Om mogelijke verbanden tussen de waargenomen variatie in huidmondjeskenmerken en mesofylpatroon te onderzoeken, hebben we microCT-beeldanalyse met hoge resolutie gebruikt om mesofylporositeit en -oppervlakte te kwantificeren in dezelfde tarwe-lijnen die hierboven voor de huidmondjeskarakterisering zijn gebruikt. Voorbeeldbeelden van T. urartu, T. araraticum en T. aestivum cv Cougar worden in Fig. 2 getoond als 3D reconstructies van bladsegmenten (Fig. 2a-c), met voorbeeld dwarsdoorsneden (Fig. 2d-f), langsdoorsneden (Fig. 2g-i), en paradermale doorsneden (Fig. 2j-l) waarin het luchtruim in geel is weergegeven en het celmateriaal in groen. Gelijkwaardige beelden voor de andere geanalyseerde tarwe lijnen worden getoond in supplementaire Fig. 1. Uit deze afbeeldingen blijkt dat alle tarwebladeren een klassieke anatomie van grasbladeren vertonen, bestaande uit parallelle nerven langs de lengteas van het blad die de begrenzing vormen voor het mesofylweefsel. De celscheiding binnen het mesofylweefsel vormt een zeer regelmatig patroon van luchtruim dat duidelijk wordt aangetoond in de longitudinale en paradermale aanzichten (Fig. 2g-l), terwijl de in Fig. 2j-l getoonde doorsneden een indicatie geven van verschillen in de grootte, verdeling en totale hoeveelheid luchtruim tussen de tarwesoorten. MicroCT maakt het mogelijk deze verschillen te kwantificeren, niet alleen in 2D-doorsneden maar over de 3D-diepte van het weefsel. Analyse van de weefselporositeit (d.w.z. het volume van de luchtruimte als percentage van het totale weefselvolume) van het adaxiale (boven) naar het abaxiale (onder) oppervlak van de bladeren bracht overeenkomsten en verschillen in de hoeveelheid en verdeling van de luchtruimte aan het licht. Alle soorten vertoonden een patroon van toenemende porositeit naarmate men verder van de epidermis verwijderd raakte, met een plateau van relatief hoge porositeit in het middengedeelte van het blad (Fig. 2m-o). De toename van de porositeit naarmate men verder in het blad komt, was het grootst bij de diploïde soorten (fig. 2m), terwijl de hexaploïde soorten een ondiepere porositeitsgradiënt vertoonden (fig. 2o) en, in het algemeen, een lagere maximale porositeitswaarde dan die welke bij de diploïde soorten werd waargenomen. De tetraploïde soorten vertoonden intermediaire patronen van porositeit over de hele bladdiepte (Fig. 2n). In het algemeen suggereert onze analyse van de structuurparameters van tarwebladeren van verschillende ploïdie dat, hoewel het basispatroon van luchtruim en weefseldistributie binnen het blad tijdens de evolutie van hexaploïde tarwe uit diploïde en tetraploïde wilde verwanten bewaard is gebleven, er selectie is geweest, direct of indirect, voor een bladstructuur met lagere porositeit (d.w.z,

Gasuitwisseling weerspiegelt luchtruim- en huidmondjespatroon

Gebruik makend van de diversiteit vertegenwoordigd in deze tarwe verwanten, onderzochten we de effecten van de waargenomen trends in de grootte/dichtheid van de huidmondjes en het mesofiele luchtruim op de gasuitwisseling, via metingen van de geleiding van de huidmondjes voor waterdamp (gs) en schattingen van de maximale geleiding van de huidmondjes (gsmax). Uit deze gegevens bleek een opvallende positieve correlatie tussen mesofylporositeit en gs (r2 = 0,915, P = 0,0007; Fig. 1l) waarbij diploïde soorten een hoge gs en een hoge porositeit vertoonden en hexaploïde bladeren een lage gs en een lage porositeit hadden (Fig. 1k). Deze sterke correlatie van mesofylporeusheid en gs bleef gehandhaafd wanneer de gepaarde gegevens van individuele replicaatplanten voor de verschillende geanalyseerde lijnen in aanmerking werden genomen (Pearson correlatie, r2 = 0,451, P = 0,0001; Supplementary Fig. 2). De afname van de poreusheid in verband met de toename van de ploïdie hield ook verband met een afname van het blootgestelde mesofyloppervlak per weefselvolume, wat resulteerde in een sterke positieve correlatie van gs en deze parameter (Pearson correlatie, r2 = 0,718, P = 0,016; Aanvullende Fig. 3a), die ook werd waargenomen wanneer het blootgestelde mesofyloppervlak werd uitgedrukt per bladoppervlak (Pearson correlatie, r2 = 0,633, P = 0,0323; Aanvullende Fig. 3b). Het verband tussen gsmax (berekend aan de hand van de metingen in aanvullende fig. 3e) en porositeit was minder sterk (Pearson correlatie, r2 = 0.487, P = 0.081; aanvullende fig. 3c) dan waargenomen met gs (fig. 1l). Analyse van gsmax en huidmondjesoppervlak toonde een omgekeerde correlatie (Pearson correlatie, r2 = 0.613, P = 0.037) (Supplementary Fig. 3d) consistent met eerder werk dat wijst op een complexe wisselwerking tussen huidmondjesgrootte en -dichtheid op gs, waarbij bladeren met hoge dichtheden van kleinere huidmondjes een grotere gs per huidmondjesoppervlak leveren dan bladeren met lage dichtheden van grotere huidmondjes20,21. Over het geheel genomen is onze analyse van gs, mesofylporeusheid en blootgesteld oppervlak consistent met de hypothese dat een groter blootgesteld mesofyloppervlak en toewijzing van weefselvolume aan luchtruimte een verhoogde gasdiffusie van en naar de mesofyl vergemakkelijkt.

De relatie tussen huidmondjes en mesofylluchtruimte

De hierboven gepresenteerde analyses zijn consistent met, maar bewijzen niet, een oorzakelijk verband tussen stomatendifferentiatie en mesofylluchtruimtevorming. Om deze hypothese te testen gebruikten we een serie transgene tarwe lijnen met veranderde huidmondjes eigenschappen. Er zijn belangrijke aanwijzingen dat de stomatale patronen worden gecontroleerd via een reeks mobiele peptidesignalen, Epidermal Patterning Factors (EPF’s)22,23,24, die effectieve hulpmiddelen bieden om de huidmondjesdichtheid te veranderen en zo het resultaat op mesofyldifferentiatie te onderzoeken7. Overexpressie van EPF1 of zijn naaste verwant EPF2 in Arabidopsis heeft geleid tot een afname van de huidmondjesdichtheid25 en overexpressie van een cognate gen in tarwe (TaEPF1) is onlangs aangetoond dat dit leidt tot een soortgelijk fenotype26.

Confocale beeldvorming van de TaEPF1-OE lijnen toonde aan dat sommige cellen in de huidmondjesvormende epidermale bestanden de eerste gebeurtenissen van huidmondjesvorming lijken te hebben ondergaan, maar niet het uiteindelijke delingsproces hebben ondergaan om het huidmondjescomplex en de porie te genereren (Fig. 3a). De mesofylcellen die direct onder deze abnormale huidmondjescellen liggen vertonen geen tekenen van celdeling, terwijl de volgroeide huidmondjes duidelijke sub-stomatholten vertonen (Fig. 3b, c). Het tellen van de aanwezigheid/afwezigheid van sub-stomatale holtes bevestigde een volledig gebrek aan luchtruimholtes onder de afgebroken stomatale lijncellen in de TaEPF1-OE tarwe lijnen, terwijl alle gedifferentieerde stomata werden gesubstitueerd door holtes (Fig. 3h). MicroCT beeldvorming van de TaEPF1-OE bladeren toonde ook een gebrek aan sub-stomatale holtes in vergelijking met WT (Fig. 3d, e) en een dichtere mesofyl (Fig. 3f, g). Kwantificering van de bladstructuur toonde aan dat de TaEPF1-OE bladeren inderdaad een lagere porositeit hadden dan WT (Fig. 3i). Metingen van de gasuitwisseling toonden een significante daling van gs aan in de TaEPF1-OE-lijnen in vergelijking met niet-transgene controlebladeren (Fig. 3j).

Om de mogelijke koppeling van sub-epidermale celscheiding met de gebeurtenissen van stomatale differentiatie verder te onderzoeken, hebben we gebruik gemaakt van het feit dat de lengteas van een grasblad een ontwikkelingsgradiënt van weefseldifferentiatie oplevert, waarbij cellen aan de proximale basis deling ondergaan om cellen te genereren die een aantal ontwikkelingstrajecten ingaan, waaronder de vorming van huidmondjes, in meer distale topregio’s23. Analyse van de controlelijn (de niet-getransformeerde ouder van de transgene TaEPF1-OE planten) bracht geen gradiënt aan het licht in de dichtheid van de huidmondjes in de regio’s aan de top, in het midden of aan de basis van volwassen blad 5 (supplementaire Fig. 4a). Een gelijkaardige analyse van vergelijkbare bladeren van de transgene TaEPF1-OE lijnen toonde echter een afname van de huidmondjesdichtheid aan de basis van blad 5 (supplementaire fig. 4b), wat weerspiegeld werd door een afname van de porositeit in deze regio, zoals aangetoond door CT-analyse (supplementaire fig. 4c). Om de gebieden aan de basis van tarwebladeren waar de huidmondjesdifferentiatie net begon beter te identificeren, gebruikten we confocale microscopie om blad 3 van tarwezaailingen in een relatief vroeg stadium van ontwikkeling te analyseren. Hieruit bleek dat de meer distale topregio’s van deze bladeren zich onderscheidden door de aanwezigheid van rijpe huidmondjescomplexen (Fig. 4a), omgeven door relatief grote luchtruimten (Fig. 4b, c). In de meer proximale basisregio’s daarentegen, waar epidermale cellen die delingspatronen ondergaan, kenmerkend voor huidmondjesdifferentiatie, duidelijk zichtbaar waren (Fig. 4d), waren, hoewel hier en daar luchtruimten zichtbaar waren in de tussenruimten van enkele aangrenzende sub-epidermale cellen (Fig. 4e), deze beide veel kleiner dan die waargenomen in het meer proximale weefsel (Fig. 4b) en vertoonden geen enkele luchtspleet. 4b) en vertoonden geen duidelijk patroon dat verband hield met de bovenliggende differentiërende huidmondjes (Fig. 4f).

Deze resultaten ondersteunen de hypothesen dat celscheiding optreedt in de sub-epidermale mesofyl als onderdeel van een endogeen ontwikkelingsprogramma, maar dat de grootte en verdeling van de uiteindelijk gevormde luchtruimten wordt bevorderd door de aanwezigheid van aangrenzende, gedifferentieerde huidmondjes. De gegevens suggereren dat er een causaal verband bestaat tussen de dichtheid van de huidmondjes en de totale porositeit van de mesofyl, en dat gasuitwisseling en mesofylporositeit functioneel met elkaar verbonden zijn.

Om mogelijke fysiologische drijfveren voor deze veranderingen te onderzoeken, vergeleken we de fotosynthetische assimilatiesnelheid, mesofyl conductantie voor CO2 (gm), en instantane watergebruiksefficiëntie (iWUE) van de tarwe lijnen met verschillende ploïdeniveaus. Dit bracht geen duidelijke trend aan het licht die assimilatiesnelheid (aanvullende Fig. 5a) of gm (aanvullende Fig. 5c) met ploïdie niveau verbond, en geen duidelijke correlatie van assimilatiesnelheid met mesofyl porositeit (aanvullende Fig. 5e). Daarentegen hadden de 6n tarwe lijnen een significant hogere iWUE dan de 2n en 4n lijnen (supplementair Fig. 5b; ANOVA met posthoc Tukey, P = 0.0005 en P = 0.013, respectievelijk). Dit werd weerspiegeld door een afname in blootgesteld mesofyloppervlak per volume, berekend uit onze CT-analyses (aanvullende Fig. 5d), waarbij 6n lijnen significant lagere waarden hadden vergeleken met de 2n lijnen (ANOVA met posthoc Tukey, P = 0,0001). Interessant is dat metingen van mesofyl celvolume via confocale lichtmicroscopie bleek een duidelijke toename met ploïdie niveau (Supplementary Fig. 5f). Rekening houdend met de vaste relatie tussen oppervlakte en volume voor vergelijkbare vormen, passen deze gegevens in de hypothese dat tijdens de selectie van moderne tarwe de mesofylcelgrootte is toegenomen, met gelijktijdige afname van het blootgestelde oppervlak en afname van de mesofylporositeit, alsmede veranderde huidmondjesparameters van toegenomen grootte en afgenomen dichtheid.

Om het mogelijke oorzakelijke verband tussen stomatendifferentiatie en mesofiele luchtruimvorming te onderzoeken, hebben we onze analyses op eudicots gericht, waarbij we een serie Arabidopsis transgene lijnen, waarvan eerder is aangetoond dat ze een veranderde stomatadichtheid hebben27 , hebben onderworpen aan een gecombineerde microCT en gasuitwisselingsanalyse. We hebben ons gericht op lijnen waarin overexpressie van EPF2 leidt tot bladeren met een significant lagere huidmondjesdichtheid (EPF2OE), en waarin verlies van EPF2 en zijn homoloog (EPF1) (epf1epf2 mutant) bladeren genereert met een significant hogere huidmondjesdichtheid25. Voorbeeld microCT beelden voor elke lijn worden getoond in Fig. 5a, b, d met SEM beelden van huidmondjes getoond in Fig. 5e, f, h en bevestiging van de verwachte huidmondjes dichtheid fenotype getoond in Fig. 5i.

Eudicot bladeren (zoals gevonden in Arabidopsis) zijn verschillend van typische monocot bladeren (geïllustreerd door tarwe in dit artikel) in dat zij kenmerkend twee mesofyl regio’s, de adaxiale palissade en abaxiale sponsachtige lagen, die te onderscheiden zijn door het hebben van ontwikkelingsgebonden verschillen in celvorm en luchtruim (porositeit)13 vertonen. Door het selecteren van volumes van belang binnen de bladeren van de Arabidopsis lijnen, verkregen we verschillende porositeit gegevens voor de respectieve palissade en sponsachtige lagen. Hoewel vergelijking van de gemiddelde totale mesofyl porositeit waarden gesuggereerd beperkte verschillen tussen de lijnen, dit weerspiegelde vooral de gelijkenis in waarden voor sponsachtige mesofyl porositeit (Supplementary Fig. 6). Daarentegen vertoonde de mesofylporeusheid van de palissade (die sterker geassocieerd is met fotosynthetische efficiëntie dan de porositeit van de sponsachtige mesofyl13 ) grotere verschillen tussen de lijnen, waarbij de palissade van epf1epf2 de hoogste porositeit had (Fig. 4j), en de hoogste stomatendichtheid (Fig. 4i). Deze gegevens wijzen op een meer gecompliceerde situatie in het eudicot Arabidopsis blad vergeleken met het monocot tarwe blad. Manipulaties die de huidmondjesdichtheid in Arabidopsis veranderen kunnen leiden tot openlijke veranderingen in de mesofylporeusheid, maar het resultaat wordt gedicteerd door de identiteit van de mesofyl (palissade of spongy). De waarnemingen passen in een interpretatie waarbij een ontwikkelingspatroon van mesofyldifferentiatie zeer vroeg in de bladontwikkeling wordt vastgelegd (waarbij palissade en sponsachtige lagen in eudicots worden gedefinieerd)28,29 waarbij de mesofylidentiteit de schaal bepaalt van modulatie van de porositeit door factoren die later in de ontwikkeling optreden, zoals signalen die geassocieerd worden met de stomatale patroonvorming. Bovendien ondersteunde, net als bij tarwe, een analyse van vroege stadia van huidmondjesdifferentiatie het idee dat de mate en omvang van de vorming van mesofylluchtruimten werd gemoduleerd door de aanwezigheid van rijpe, gedifferentieerde huidmondjes. Zo waren tijdens de groeifase van het blad, waarin de epidermale celdelingen die tot huidmondjes leidden plaatsvonden (Fig. 4j), luchtruimten zichtbaar in de tussenruimten van sommige sub-epidermale cellen (Fig. 4k), maar er was geen duidelijke overeenkomst in het patroon van deze luchtruimten en de bovenliggende differentiërende huidmondjes (Fig. 4l). In het stadium van ontwikkeling waarin volledig gedifferentieerde huidmondjes zichtbaar waren (Fig. 4g), waren er talrijke, grote luchtruimten in de hele subepidermale palissade mesofyl (Fig. 4h), met huidmondjes die altijd door een luchtruimte werden gesubstitueerd (Fig.

Stomatale geleiding en modulatie van mesofyl luchtruim

Onze gegevens van zowel tarwe als Arabidopsis ondersteunen de hypothese dat de aanwezigheid van huidmondjes de mate van mesofyl porositeit moduleert. Echter, onze waarneming dat de palissade porositeit in de EPF2OE lijn in Arabidopsis niet verschilt van Col-0 (Fig. 5j), ondanks een enorme afname van de huidmondjes dichtheid (Fig. 5i), suggereert dat het niet simpelweg een direct proces is waarbij differentiatie van bewakingscellen leidt tot een evenredige toename / afname van de mesofyl celscheiding (zoals is gesuggereerd7). Een alternatieve (maar niet uitsluitende) hypothese is dat het feitelijke functioneren van de huidmondjes om gasuitwisseling mogelijk te maken een belangrijke factor is die de dichtheid van de huidmondjes en de porositeit van de mesofyl met elkaar verbindt. Onze tarwegegevens tonen inderdaad een sterke positieve correlatie tussen mesofylporositeit en gs (Figs. 1l, 3i, j). Wij hebben deze hypothese getest in Arabidopsis door gebruik te maken van een recent gekarakteriseerde huidmondjesmutant, focl1-1, waarin de laatste stappen van de vorming van de cuticulaire richel van de wachter verstoord zijn30. Het resultaat is dat de meeste huidmondjes poriën vormen die aanvankelijk volledig bedekt zijn met een lipide/cuticula laag. Naarmate de huidmondjes volgroeid zijn, scheurt de cuticula over ongeveer 10% van de huidmondjes, wat onvermijdelijk leidt tot gaten die een beperkte gasuitwisseling in en uit het blad mogelijk moeten maken via de gevormde zichtbare sub-stomatale holtes. Een gedeeltelijk bedekte focl1-1 stomaat wordt getoond in Fig. 5g en kan vergeleken worden met de open stomatale poriën waargenomen in Col-0, EPF2OE, en epf1epf2 bladeren (Fig. 5e-h). De aanwezigheid van gedeeltelijk bedekte huidmondjesporiën is een nuttig instrument om na te gaan in hoeverre de mesofylporositeit verband houdt met de gasuitwisseling. Een paarsgewijze gecombineerde microCT en gasuitwisseling analyse van de vier Arabidopsis lijnen bleek een zeer significante positieve correlatie van gs en palissade porositeit (Pearson correlatie, r2 = 0.471, P = 0.0002; Fig. 5l), met de focl-1 mutant gegevens groeperen onder die voor de Col-0 controle en op een lijn met de EPF2OE monsters. Wanneer de assimilatiesnelheid voor individuele bladeren van de mutantplanten wordt bekeken in relatie tot de palissadeporeusheid, is er weliswaar een zwakke correlatie (aanvullende Fig. 7a; Pearson correlatie, r2 = 0,289, P = 0,007), maar de relatie van de porositeit met de watergebruiksefficiëntie is veel sterker (aanvullende Fig. 7b; Pearson correlatie, r2 = 0,526, P = 0,0001), consistent met de hypothese dat de focl-1 mutant een waterverbruiksefficiëntie heeft die vergelijkbaar is met die van de Col-0 controle.0001), in overeenstemming met de hypothese dat het beperken van waterverlies de belangrijkste drijfveer kan zijn voor de waargenomen veranderingen in de bladstructuur.

Al met al ondersteunen deze waarnemingen het idee dat, naast een mogelijk direct signaal van gedifferentieerde bewakingscellen, de feitelijke werking van huidmondjes om gasuitwisseling mogelijk te maken een belangrijke functionele rol speelt in het bevorderen van de celscheiding en groei die uiteindelijk de mesofylporeusheid bepalen.