Hoe Rb-eiwitten de celproliferatie controleren is niet volledig begrepen. Er is vastgesteld dat RB-eiwit associeert met een grote verscheidenheid aan transcriptiefactoren en chromatine-geassocieerde complexen.
Rb-eiwitbinding remt het transcriptionele activeringsvermogen van E2F-factoren, waarbij het transcriptionele activeringsdomein wordt gemaskeerd en, in sommige gevallen, E2F-factoren worden omgezet in transcriptie-repressoren. Het belang van de Rb-E2F interactie in de controle van de celgroei wordt aangetoond door de bevinding dat alle natuurlijk voorkomende Rb mutanten geïsoleerd uit menselijke tumoren het vermogen missen om E2F te binden en negatief te reguleren (Qian et al.,
Rb-eiwitten zouden de expressie van door E2F gereguleerde genen op twee manieren remmen (Dyson et al., 2002): door directe binding en blokkering van het activeringsdomein van E2F-eiwitten of door actieve repressie via de rekrutering van HDAC, SWI/SNF-factoren, Polycomb-groep eiwitten (Dahiya et al., 2001) of methyltransferase (Vandel et al, 2001).
Binding aan E2F-transcriptiefactoren
De E2F-familie van transcriptiefactoren bestaat uit ten minste zeven E2F-familieleden, E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, 2A7E en E2F7.
Een functionele E2F-transcriptiefactor bestaat uit een heterodimer dat een E2F-polypeptide en een DP-polypeptide bevat (Helin et al, 1993). Elk van de E2F-polypeptiden kan heterodimeren met DP1 of DP2 (DP3) (Ormondroyd et al., 1995), hoewel de E2F7-transcriptiefactor DNA bindt op een DP-onafhankelijke manier.
Er zijn functionele en structurele verschillen binnen de E2F-familie. E2F1, E2F2 en E2F3 zijn transcriptionele activatoren, die interageren met pRB. E2F4 en E2F5 zijn transcriptionele repressors en binden vooral aan Rb2/p130 en p107 (Gaubatz et al., 2000). 2A7E lijkt geen pocket-eiwitinteractiedomein te hebben; het interageert met Polycomb-eiwitten en onderdrukt de transcriptie (Morkel et al., 1997). De recent geïdentificeerde E2F7 en E2F8 worden ook verondersteld specifieke promotors te onderdrukken (Di Stefano et al., 2003). De DP heterodimerisatie partner lijkt niet bepalend te zijn voor de bindingspecificiteit van E2F factoren voor de pocket eiwitten. DP-factoren functioneren echter wel in het stabiliseren van de interactie tussen E2F-factoren en de Rb-eiwitten (Helin et al., 1993).
Tijdens de celproliferatierespons is er een verschillende expressie van de verschillende E2F’s, met een toename van E2F3 in vroeg-G1 tot midden-G1 en met een toename van E2F1 en E2F2 op de G1/S-grens (Johnson et al., 1998). E2F4 en E2F5 komen tot expressie gedurende de gehele celcyclus, maar in G0 en vroeg G1 worden ze gebonden aan de kern door p107 en Rb2/p130, en vormen zo transcriptionele repressor complexen. p107 en Rb2/p130 rekruteren E2F4 in de celkernen, en induceren zo de repressie van S-fase genen transcriptie en celproliferatie. Intussen wordt aangenomen dat pRb E2F1-3 bindt, hetzij op of weg van E2F-responderende promotors (De La Luna et al., 1996).
Na stimulatie gaan rustende cellen de celcyclus in, en in de vroege G1 fase wordt pRb gefosforyleerd en komen bijgevolg E2F1-3 transcriptiefactoren vrij, terwijl we pas in het midden van G1 tot laat in G1 het verlies van Rb2/p130 complexen kunnen vaststellen. Daarom worden in de late G1-fase Rb-eiwitten gefosforyleerd en dissociëren ze van E2F’s; E2F4 en E2F5 verplaatsen zich naar het cytoplasma en E2F1-3 binden zich aan de E2F-responderende promotors op plaatsen die vaak verschillend zijn van de bindingsplaats van E2F-repressoreiwitten (Cinti et al., 2000). Bij de overgang van de G1/S-fase kunnen nog complexen worden gedetecteerd die p107 bevatten in associatie met E2F4 (Mudryj, 1991). Deze E2F4-p107 complexen bevatten ook cycline E of A en cdk2 (Shirodkar, 1992). Er is ook aangetoond dat E2F-p130 complexen accumuleren, wanneer sommige celtypes, waaronder myoblasten en melanocyten, terminale differentiatie ondergaan (Shin et al., 1995).
pRb en de verwante eiwitten p107 en Rb2/p130 hebben geen volledig redundante functie in het reguleren van E2F genen transcriptie; in plaats daarvan vertonen zij een grote redundantie op celcyclus niveau. Bijvoorbeeld, in pRb-/- fibroblasten is er een compensatoire toename van p107 eiwitniveaus tijdens de arrestatie in G0/G1 fase (Sage et al., 2003). Het mechanisme van dit antiproliferatieve effect van p107 is onbekend – p107 zou pRb kunnen vervangen in de regulatie van E2F1-3 of het zou sommige E2F-responsieve genen kunnen onderdrukken die gecontroleerd worden door pRb (Lee et al., 2002). Bovendien kan pRb ook E2F4 binden in vitro, maar slaagt het er niet in de E2F-responsieve promotor te reguleren in p107-/- en p130-/- cellen. Er is aangetoond dat het pRb-E2F4 complex in p107-/- cellen er niet in slaagt dezelfde promoter sites te binden die gewoonlijk door het p107-E2F4 complex in wild-type cellen worden gekoppeld (Rayman et al., 2002).
Hoewel pRb betrokken is bij de repressie van een beperkte set van E2F genen in G0 en G1 cellen, en recentelijk is zijn rol in de repressie van het cycline E gen gedefinieerd. De promotor van cycline E wordt namelijk gedereguleerd in cellen die pRb verloren hebben, ook al is het p107/p130-E2F4 complex nog steeds beschikbaar (Herrera et al., 1996). pRb medieert de repressie van de promotor van cycline E door de rekrutering van HDAC en histon-methyltransferase op een bepaalde E2F-SP1 plaats die exclusief verbonden is door de pRb-E2F1-3 complexen. Cycline E wordt niet alleen gederepresseerd door het verlies van pRb maar ook door het verlies van E2F1-3 eiwitten, zodat het duidelijk is dat E2F1-3 eiwitten in dit geval als repressors optreden in plaats van activators (Wu et al., 2001). p107 of Rb2/p130 kunnen pRb alleen vervangen als ze in voldoende hoeveelheid aanwezig zijn om E2F1-3 eiwitten te binden (Lee et al., 2002).
pRb kan de proliferatie remmen via een E2F-onafhankelijk mechanisme. Zo kan pRb de vorming van promyelocytische leukemie (PML) nucleaire lichaampjes induceren (Fang et al., 2002), de expressie van p27 verhogen (zie hierboven), de Ras-signalering onderdrukken (Lee et al, 2002) en werken samen met hLin-9, een eiwit dat net als pRb betrokken is bij het onderdrukken van transformatie, maar op een E2F-onafhankelijke manier (Gagrica et al., 2004).
RB/E2F repressor complexen kunnen ook op een Cdk-onafhankelijke manier worden gereguleerd. Bijvoorbeeld, transformerende groeifactor-β rekruteert E2F4/p107 en E2F5/p107 door de c-myc promotor ongeacht de cel fase, en het is nog steeds stabiel in de aanwezigheid van hoge activiteit van Cdk (Chen et al., 2004). In menselijke cellen werd vastgesteld dat p107 en p130 tijdens de S-fase verwijderd worden van de promotors van genen die door de celcyclus worden gereguleerd, maar zich nog steeds bevinden aan de promotors van apoptotische genen (Young et al., 2004). De regulatie van het RB/E2F complex op een Cdk-onafhankelijke manier is nog niet goed begrepen.
Binding aan eiwitten die de chromatinestructuur wijzigen
Repressie door Rb-eiwitten vereist de geconserveerde A- en B-domeinen van het zak-eiwit en lijkt de associatie van andere eiwitten naast E2F-factoren te impliceren. Rb eiwitten onderdrukken transcriptie door de chromatine structuur te remodelleren via interactie met eiwitten zoals hBRM, BRG1, HDAC1 en SUV39H1 (Shao et al., 1995), die respectievelijk betrokken zijn bij nucleosoom remodellering, histon acetylering/deacetylering en methylering.
hBRM en BRG1 zijn zoogdier homologs van componenten van het gist chromatine remodelleringscomplex SNF2/SWI2 (Strober et al., 1996). Van zowel BRG1 als hBRM is aangetoond dat ze associëren met pRB en betrokken zijn bij pRb-gemedieerde repressie. Een fysische interactie tussen pRb en BRG1 is niet vereist voor pRB-geïnduceerde groeistilstand en transcriptionele repressie van E2F doelgenen (Kang et al., 2004).
Histon deacetylase 1 is een HDAC waarvan recent is aangetoond dat het door pRb wordt gerekruteerd in E2F complexen en een rol speelt in de repressie van cycline E genexpressie (Magnaghi-Jaulin et al., 1998). Histonen zijn over het algemeen gehyperacetyleerd aan de promotors van actief getranscribeerde genen, maar zijn gehypoacetyleerd aan silenced genen. Histon deacetylase wordt over het algemeen gerekruteerd op gen promotors door vele transcriptionele regulatoren. pRB associeert met HDAC activiteit in vivo en bindt aan klasse I HDACs (HDAC1-HDAC3) in vitro. pRB-gemedieerde repressie wordt versterkt door HDAC1 in transiënte transfectie-experimenten, en om deze associatie tussen pRb en HDAC te bevestigen is aangetoond dat remming van HDAC-activiteit met trichostatine A interfereert met pRB-gemedieerde repressie bij een subset van E2F-gereguleerde promotors (Zhang et al., 2000). Histon deacetylase is dus betrokken bij de modulatie van de repressieve activiteit van pRb op E2F genpromotors. De rekrutering van HDAC kan indirect zijn en gepaard gaan met de rekrutering van andere bindingseiwitten zoals RBP1, corepressors en chromatine-remodelingseiwitten (Lai et al., 1999). Rayman et al. (2002) hebben aangetoond dat in Rb-/- cellen, HDAC op E2F gen promotors zit; dit liet ons toe de hypothese te stellen dat pRb niet strikt noodzakelijk is in E2F transcriptionele repressie, maar dat er andere mechanismen bij betrokken kunnen zijn. Histon acetyltransferase eiwitten (CCBP, p300, Tip6, etc.) nemen deel aan de activatie van E2F eiwitten (Condorelli en Giordano, 1997); ze interageren met het activatie domein van E2F eiwitten en stimuleren hun activatie.
SUV39H1 is een methyltransferase dat specifiek K9 van histon H3 methyleert en samenwerkt met pRb in de repressie van de promotor van E2F-responderende genen. In cellen die pRB missen is er geen associatie van me-K9-H3 in deze promotors (Rea et al., 2000); deze resultaten zijn met name ontwikkeld door cycline E te bestuderen, één van de beste E2F-doelgenen die door pRb gemoduleerd worden. Zowel pRb als SUV39H1 zijn rechtstreeks betrokken bij de onderdrukking van de cycline E transcriptie, aangezien in zowel pRb-/- als SUV39H1-/- dubbel knockout cellen, cycline E overexpressief is. Rb eiwitten zijn ook in staat om de assemblage van pre-initiatie complexen te verhinderen, waardoor de activiteit van transcriptiefactoren die gerekruteerd worden op E2F gen promotors wordt geremd (Ross et al., 1999).
Het type repressie dat Rb eiwitten uitoefenen op celgroei is afhankelijk van het type corepressoreiwitten dat E2F doelgenen bindt. Zo kunnen verschillende typen van transcriptionele repressie werken op dezelfde promotor in een andere cellulaire toestand of in een ander cel fenotype (Dimova en Dyson, 2005).
Het pRb/E2F complex kan ook stabiele repressie bevorderen onafhankelijk van de celcyclus positie of door resistent te zijn tegen celcyclus progressie. Helaas zijn de mechanismen waardoor pRb betrokken is bij processen die E2F-afhankelijke transcriptie permanent onderdrukken, tot nu toe niet goed bekend. Bijvoorbeeld, E2F4 kan gevonden worden op E2F-gereguleerde promotors in de S fase, maar het is onduidelijk of het werkt als een activator. Senescente cellen, bijvoorbeeld, vertonen een hoger niveau van H3K9 methylering in E2F-responsieve promotors in vergelijking met rustende cellen (Narita et al., 2003). Rb eiwitten mediëren E2F-responsieve genen zowel in een rustende als in een senescente/differentiële toestand, waarbij de eerste gekenmerkt wordt door lage niveaus van H3K9 methylering, en de laatste door hoge niveaus van H3K9 methylering. De identiteit van het histon-methyltransferase dat op de promotor wordt gerekruteerd kan ook de overgang tussen een rustende cel en een senescente/differente cel moduleren.