Plantmateriaal, kweekomstandigheden en wortelbehandelingen
Wild type Medicago truncatula-R108 zaailingen, gebruikt voor deze studie, werden in 2008 geoogst bij INRA-Montpellier, Frankrijk, en bewaard bij – 20 °C in een buis waarin de lege ruimte was opgevuld met hydrofiel katoen om vocht te verminderen. De zaden werden licht geverticuteerd met schuurpapier (korrel P80) en vervolgens 30 minuten onder agitatie aan het oppervlak gesteriliseerd in een oplossing van 1/4 van een commercieel bleekmiddel in 250 mL water, aangevuld met 30 µL detergent. De zaden werden vervolgens driemaal grondig gewassen in steriel water onder een laminaire stroom. Als er nog detergent aanwezig was, werden extra wasbeurten uitgevoerd. Na de laatste wasbeurt werden de zaden 1 uur in water op kamertemperatuur gehouden om te impregneren. Overtollig water werd verwijderd en de zaden werden willekeurig verspreid over een watermedium met 1% agar (HP 696-Kalys). De platen werden ondersteboven geplaatst bij 4 °C in het donker gedurende 3 tot 4 dagen stratificatie. Ten slotte werd ontkieming bereikt bij kamertemperatuur in het donker gedurende een nacht, waarbij de platen ondersteboven werden gehouden om een rechte wortelgroei buiten de agar mogelijk te maken, en om verdere overbrenging op een nieuw kweekmedium te vergemakkelijken. Zaailingen werden vervolgens gekweekt op gemodificeerd Fahraeus-medium, verhard met 1,3% agar (HP 696-Kalys) (gemodificeerd Fahraeus-medium: CaCl2 1 mM, MgSO4 0,5 mM, KH2PO4 0,7 mM, Na2HPO4 0,8 mM, Fe EDTA 50 μM, 0,1 mg/l van elk van de volgende micro-elementen: MnSO4, CuSO4, ZnSO4, H3BO3 et Na2MoO4, pH aangepast op 7,5 met KOH) . Maximaal 8 zaailingen met wortels van ongeveer 1 cm werden overgebracht per vierkante petrischaal (12 cm × 12 cm) met het kweekmedium bedekt met een inert absorberend papier (Mega International-USA) om wortelpenetratie te voorkomen. Tijdens de overdracht werd 125 µL steriel Milli-Q water aan elke wortel toegevoegd om uitdroging te voorkomen, alvorens de dozen met Millipore-tape te sluiten. Zwarte zakken werden gebruikt om het onderste deel van de schotel te bedekken en zo de wortels tegen licht te beschermen. Ten slotte werden de schalen met een hoek van ongeveer 45° ten opzichte van de verticaal geplaatst in kweekruimten met een temperatuur van 24 °C, 60% luchtvochtigheid en 16 uur verlichting.
Om het RHS-algoritme te testen, werden de wortels aan verschillende behandelingen onderworpen. Een eerste reeks onbehandelde planten werd gedurende 3 dagen na de overdracht gekweekt, voordat de wortels onder een microscoop in beeld werden gebracht. Voor de behandelde condities werden 2 dagen na de overdracht de schalen geopend en horizontaal geplaatst om 20 mL behandelingsoplossingen toe te voegen bestaande uit ofwel 10 nM Nod factor (NF), ofwel 10 µM Indole-3-azijnzuur (IAA) verdund in steriel Milli-Q water. Als controle werden de planten behandeld met steriele Milli-Q. Na 1 uur onderdompeling van de wortels werd overtollige vloeistof verwijderd, en werden de schalen gesloten en 18 uur teruggezet in de kweekruimte.
Arabidopsis thaliana (Col0) zaden werden gedurende 3 uur aan de oppervlakte gesteriliseerd met chloorgas, geproduceerd door 3 mL HCl 37% te mengen met 50 mL natriumhypochloriet 10%. De zaden werden verspreid in een vierkante schaal (12 cm × 12 cm) gevuld met 1/2MS-medium dat gelatineerd was met 0,8% plantenagar (Duchefa). De schaal werd gedurende 2 dagen in het donker bewaard bij 4 °C voor stratificatie en vervolgens bij 21 °C, 16 uur verlichting voor kieming en kweek. Na 9 dagen werden de zaailingen gebruikt voor beeldacquisitie.
Brachypodium distachyon (Bd21-3) zaden werden met een pincet van de bolster gepeld, vervolgens gedurende 15 min op een wip gesteriliseerd in 1 mL sterilisatiebuffer (20% huishoudbleekmiddel, 0,1% Tween20) en 4 maal gespoeld in dubbel gedestilleerd water. De zaden werden gedeponeerd in een vierkante schaal (12 cm × 12 cm) gevuld met 1/2MS aangevuld met 1% agar, met de embryopool van de lange as van het zaad naar beneden gericht. Na 2 dagen van stratificatie bij 4 ° C, werden de gerechten overgebracht en plaats verticaal in een groeikamer bij 28 ° C en 16 uur verlichting voor kieming. De zaailingen waren klaar voor beeldvorming 3 dagen na ontkieming.
Beeldacquisitie
Voordat in detail de verschillende stappen van de methode, de hele pijplijn beschrijven van het hele proces dat beeldvorming, Fiji Script analyse, het sorteren van gegevens en sigmoid fit omvat is samengevat in Additional file 2:
Drie dagen na overbrenging naar de groeikamer (d.w.z. 18 uur na specifieke behandelingen indien van toepassing), werden wortels uit de luchtorganen gehaald en tussen dia en dekglaasje in vloeibaar Fahareus medium geplaatst. Een helderveldmicroscoop (Leica DMI6000 met gemotoriseerd podium x, y, z. LAS software, Halogeen Leica lamp, 5× Dry objectief met 0.15 numerieke apertuur, Hamamatsu Orca ER-1395 Camera) werd gebruikt om beelden te verkrijgen met een resolutie van 19.703 ppi. De breedte van de RV wordt gemiddeld door 10 pixels bestreken. De gemotoriseerde fase van de microscoop en de mozaïek reconstitutie faciliteiten van LAS software werden gebruikt voor het verwerven en reconstitueren van alle geanalyseerde beelden (analoge tools zijn vrij beschikbaar in ImageJ en Fiji ). De precieze selectie van het einde van de wortelzone om te verwerven is niet vereist, aangezien deze selectie later zal worden gestandaardiseerd met het sigmoïdale model. Om scherpe beelden van RHs langs de wortel te verkrijgen, werden Z-stacks van vijf beelden met een tussenafstand van 100 µm verkregen.
Brightfield beelden van Arabidopsis wortels werden verkregen met een resolutie van 15.631 ppi door het plaatsen van de geopende kweekbak direct onder een Nikon SMZ18 stereoscoop, uitgerust met een 0,5× Nikon SHR Plan Apo WD:71 objectief, zoom 8, en Hamamatsu C11440 camera. Drie XY posities werden verworven per wortel door het handmatig verplaatsen van de doos onder het gezichtsveld, zodat twee opeenvolgende beelden elkaar overlapten. Geen Z-stack was nodig.
Brachypodium zaailingen werden afgebeeld tussen microscoop dia’s en dekglaasjes gevuld met water, het houden van de bladeren onbedekt van het dekglaasje. De beelden werden verkregen met hetzelfde optische systeem als voor Arabidopsis zaailingen, met een uiteindelijke vergroting van 40×. Twee XY posities werden verworven per wortel om 2 opeenvolgende beelden te laten overlappen. Geen Z-stack nodig was.
XY beelden verkregen voor Arabidopsis en Brachypodium werden gestikt in Fiji met behulp van de plugin 2D Stitching . Als het beeld overlap was niet voldoende voor 2D Stitching goed te werken, werd de stiksels handmatig uitgevoerd met behulp van de plugin MosaicJ .
Root Hair Sizer: beeldverwerking
Alle beeldverwerking werd gedaan met behulp van Fiji open source software, maar kan ook worden bereikt in ImageJ open source software met AnalyzeSkeleton en Auto_Threshold plugins geïnstalleerd . Als startpunt is een enkel beeld nodig waarop alle RHs zijn gefocust. Hier hebben we gegenereerd Z-projecties door het optellen van vijf verworven plakjes, maar elke overname en verwerking methode die een scherp beeld van RHs langs de wortel kan worden gebruikt.
De rest van de verwerking kan worden toegepast door het uitvoeren van de RHS algoritme beschikbaar in Extra bestand 1: Script 1. Een samenvatting van alle stappen van het algoritme is ook beschikbaar in tabel 1 en geïllustreerd in Figs. 2 en Additional file 2: Fig. S5. Bijkomend bestand 5: Movie 1 is beschikbaar om het begrip van de interface te verduidelijken. Het eerste deel van RHS verwerking bestaat uit de detectie van RHs gebied. De methode, geïnspireerd door Inoue et al. , bestaat uit het dorsen van de pixel intensiteit. Een eerste proces zal de omtrek van de RHs detecteren, terwijl een tweede proces alleen de omtrek van de wortel verwerkt. Om handmatige definitie van de pixel intensiteit drempel te vermijden, werd een geautomatiseerde drempel gebruikt. Detectie van wortel met RHs werd bereikt met de Bernsen methode, terwijl de wortelas alleen werd gedetecteerd met de Phansalkar methode (Additional file 2: Fig. S7 en Tabel 1-stappen 3 en 4) . Om glad te strijken en gaten van beide binaire beelden gegenereerd te vullen, werden verschillende stappen van pixel dilataties en erosie toegepast (Tabel 1-stappen 3.2 en 4.2). Het wortelas-beeld werd vervolgens afgetrokken van het gehele wortelbeeld (wortel met RHs) (Additional file 2: Fig. S7 en Tabel 1-stap 5) om het oppervlak te verkrijgen dat alleen door RHs wordt bedekt. Achtergrondruis werd gewist in stap 5.2 (Tabel 1-stap 5.2).
Omdat in de volgende stappen de wortel recht moet zijn, wordt de wortelmiddellijn (RML) teruggevonden als het langste pad van het skelet verkregen uit het wortelasbeeld na het uitvoeren van de commando’s “Skeletonize” en “Skelet analyseren (2D/3D)” (Additional file 2: Fig. S7 en Tabel 1-stappen 8.1 en 8.2). Het RML beeld wordt vervolgens omgezet in een poly-lineaire selectie (stappen 8.3 en 8.4), en rechtgetrokken met het Fiji ‘Straighten’ commando (Additional file 2: Fig. S7 en Tabel 1-stap 10). Aangezien ‘Straighten’ een afbeelding met grijsniveaus genereert, wordt een extra binarisatie uitgevoerd (tabel 1-stappen 11 en 12). In het uiteindelijke beeld hebben RH pixels een waarde van 1, en achtergrond pixels een waarde van 0.
Root Hair Sizer: RH length measurement
Root hair length measurement is done in two steps, as detailed in “Results” section (Fig. 2). Eerst wordt een rechthoekige selectie geschoven langs de wortelas van het rechtgetrokken, gebineariseerde beeld van RHs, waarbij de hoogte “L” van RH oppervlak binnen de selectie bij elke stap wordt gemeten (Tabel 1-stappen 14.1 tot 14.3) met formule (1). Ten tweede werd een bepaald aantal (gewoonlijk 10) opeenvolgende individuele L-waarden Max-gefilterd om een Lmax-waarde te verkrijgen als een schatting van de lengte van de RV’s (tabel 1-stappen 14.4 tot 14.5). Elke Lmax waarde is geassocieerd met een overeenkomstige afstand van de wortelpunt en weggeschreven naar een tabel.
Root Hair Sizer: instelbare instellingen
Afhankelijk van het type wortel en de eigenschappen van het verkregen beeld, kan het nodig zijn om sommige instellingen aan te passen. Instelbare stappen zijn gemarkeerd met een aantal sterretjes in het RHS script, terwijl de instellingen die we hebben gebruikt in de Medicago voorbeelden in tabel 1 staan. Bij het dorsen van het beeld kan de radiuswaarde voor de Bernsen- en Phansalkar-dorseermethoden worden aangepast, bv. voor beelden met verschillende resolutie, evenals het aantal erosies en dilataties dat direct daarna wordt toegepast. Als het profiel van de wortelharen en het type optische opstelling dat voor de acquisitie wordt gebruikt, sterk verschillen van het hier gegeven voorbeeld, worden de gebruikers aangemoedigd de drempelstrategie te personaliseren om ze aan hun eigen instellingen aan te passen. Voor Arabidopsis wortels bijvoorbeeld, werd de Phansalkar in plaats van Bernsen drempelmethode gebruikt bij stap 3 om RH vorm te detecteren, terwijl de Bernsen in plaats van Phansalkar drempelmethode werd gebruikt bij stap 4 om wortelvorm te detecteren. Bovendien was stap 5 niet langer nodig (Additional file 4: Script 4). Het wortelskeletiseringsproces behoeft wellicht ook enige aanpassing. De mate van vereenvoudiging van de polylijn die de middellijn van de wortel markeert, verkregen na de commando’s ‘Skeletonize’ en ‘Analyse Skeleton (2D/3D)’, kan worden aangepast voor veel grotere of kleinere beelden. Tenslotte, bij het rechtzetten is het belangrijk om de breedte van de poly-lijn aan te passen zodat deze alle RHs omvat.
Bij het uitvoeren van RHS kan de gebruiker in een dialoogvenster het te analyseren wortelsegment selecteren. De breedte w van de scanselectie kan worden aangepast zodat deze iets dunner is dan één RV (van 1/2 tot 2/3). Tenslotte kan ook de intervalgrootte waarin Lmax moet worden gekozen worden aangepast. Een interval van 10 selecties om Lmax te verzamelen leek accuraat in de hier getoonde voorbeelden. Het effect van het variëren van deze parameter, die het aantal behouden datapunten regelt versus de variabiliteit van de gegevens door b.v. “gaten” in het RV-profiel, wordt geïllustreerd in Additional file 2:
Root Hair Sizer stelt ook voor om het beeld te annoteren als sommige delen van de wortel uit de analyse moeten worden verwijderd. De positie van deze commentaren langs de wortel worden in de uiteindelijke tabel teruggevonden door de annotatie van elk gegevenspunt als 1 en 0 (respectievelijk de aanwezigheid en afwezigheid van het commentaar op dit punt) op gescheiden kolommen. Bovendien biedt RHS de gebruiker in verschillende stappen de mogelijkheid het automatische proces van het algoritme te controleren en eventueel handmatig te corrigeren. Alle automatische definities en handmatige correcties worden geregistreerd en opgeslagen als een “region of interest” (ROI). Nadat RHS een eerste keer is uitgevoerd, is het mogelijk om een ander gebied van de wortel te analyseren met behulp van ROI die bij het originele beeld horen, door gebruik te maken van het script dat in Additional file 6: Script 2 wordt gepresenteerd. Om dit script uit te voeren, is het belangrijk om dezelfde RML-breedte te gebruiken en het eerste dialoogvenster te vullen met dezelfde commentaarnamen die worden gebruikt met het hoofd-RHS-algoritme.
Gegevensverwerking
De gegevens die zijn verzameld met RHS zijn gesorteerd met Excel-spreadsheet-software. Voor alle gepresenteerde resultaten zijn gebieden met een artefact (bijvoorbeeld een luchtbel of stof) uit de analyse verwijderd. Bij sommige beelden vertoonde één kant van de wortel over de gehele lengte een kleinere RH dan de andere kant, meestal bij naast elkaar groeiende wortels. In deze gevallen werd alleen de zijde met de langere RH voor de analyse behouden. Andere specifieke gegevenssorteringen of parameters worden in de legenda van de figuur of in de tekst vermeld. Zoals hierboven in “Resultaten” is beschreven, passen we de datapunten tweemaal na elkaar aan met een sigmoïde. Dan, zoals aangetoond in Fig. 3b, Additional file 2: Figs. S3, S4, kregen we een goede schatting van het gedeelte van de curve dat een sigmoïde vorm heeft.
De gegevens werden ingepast met de sigmoïde curve f(links( d rechts)
Deze eerste fit levert het buigpunt d50_1 en de uitschuiflengte δ_1. Vervolgens stellen we de grenzen voor de tweede fit tussen d50_1 ± 5δ_1.
Sigmoïdale aanpassing werd bereikt met GraphPad Prism software. Gegevens verkregen uit elk beeld werden afzonderlijk behandeld. Een aanpassing met de kleinste kwadraten werd toegepast met gebruikmaking van de volgende regels om de beginwaarden van de aanpassing voor elk beeld te definiëren:
met Labsolute min en Labsolute max respectievelijk de minimale en maximale RV-lengte gemeten in alle gegevens verkregen langs de gehele wortel van het beschouwde beeld.
Meting van de groeisnelheid van de wortels
Deze meting werd uitgevoerd op afzonderlijke partijen wortels in dezelfde conditie als voor de RV-lengtemeting. Na 1 uur onderdompeling van de wortels in de behandelingsoplossing werden de dozen leeggemaakt, vervolgens gesloten en werd de RT-positie met een stift op de dop van de doos gemarkeerd. Na 18 uur incubatie werd de nieuwe RT-positie gemarkeerd en werd de doos gescand. De afstand tussen twee opeenvolgende punten werd vervolgens gemeten met Fiji software. De wortelgroeisnelheid kan worden gemeten als de verhouding tussen deze afstand en de tijd tussen de twee metingen. De wortelgroei werd gemeten bij twee biologische replicaten, wat de volgende waarden opleverde (gemiddelde ± SE): onbehandeld: 296 ± 17 µm/h (n = 26); H2O: 304 ± 16 µm/h (n = 26); NF: 225 ± 15 µm/h (n = 23); IAA: 55 ± 3 µm/h (n = 19).
Statistieken
GraphPad Prism software werd gebruikt voor de statistische analyse en sigmoïdale fitting. Alle details over steekproefgrootte, biologische replicaten of afgeleide tests worden gespecificeerd in de figuur legenden.