In dit bericht bespreken we het fenomeen van tweede orde diffractie door een monochromator en de problemen die dit kan veroorzaken bij fluorescentie spectroscopie.
Dit is de tweede in een serie blogposts (lees eerste blogpost) waarin we de meest gemaakte fouten en experimentele artefacten bespreken die optreden bij het meten van fluorescentiespectra. Deze lijst was oorspronkelijk geïnspireerd op de ‘Rogue’s Gallery of Fluorescence Artefacts and Errors’ in het uitstekende boek ‘Introduction to Fluorescence’ van David M. Jameson.1 Deze blogposts zullen op die lijst voortbouwen met de ervaringen van onze eigen operations engineers en toepassingswetenschappers met de veelvoorkomende fouten die zij waarnemen bij het beantwoorden van vragen van klanten, het bezoeken van laboratoria en…het af en toe zelf maken.
Wat is tweede-ordeverschuiving?
In fluorescentiespectroscopie worden monochromatoren gebruikt om de excitatie- en emissiegolflengten te selecteren. Een typische fluorescentiespectrometer bestaat uit twee monochromatoren; een excitatiemonochromator om de gewenste excitatiegolflengte te selecteren en een emissiemonochromator om te selecteren welke golflengte de detector bereikt. Voor meer informatie over hoe een fluorescentiespectrometer werkt, zie ons artikel “Inleiding tot fluorescentiemetingen & Instrumentatie”.
Monochromatoren maken gebruik van diffractieroosters om de gewenste golflengte te isoleren van invallend breedbandlicht. Het breedbandlicht wordt op het diffractierooster geschenen en de verschillende golflengten waaruit het licht bestaat, worden onder verschillende hoeken gebroken om aan de vergelijking van het rooster te voldoen,
waarbij m de orde van de diffractie is, λ de golflengte van het verstrooide licht is, d de groefafstand van de tralie is, de hoek tussen het invallende licht en de normaal van de tralie is, θί de hoek tussen het verstrooide licht en de normaal van de tralie is. Men kan zien dat bij een constante elke golflengte van het licht onder een andere hoek wordt gebroken, waardoor de monochromator de gewenste golflengte kan isoleren. Ook is te zien dat voor constante en constante λ aan de vergelijking wordt voldaan met verschillende hoeken, afhankelijk van de diffractievolgorde m, die positieve en negatieve gehele waarden kan aannemen (…-2, -1, 0, 1, 2…). Een waarde van ±1 wordt diffractie van de eerste orde genoemd en treedt op in de richting van de normaal van het rooster en heeft de hoogste intensiteit. Een waarde van ±2 staat bekend als diffractie van de tweede orde en treedt op onder een kleinere hoek en is zwakker in intensiteit. Diffractie bij hogere orden volgt een vergelijkbaar patroon van toenemende hoek weg van de normaal en afnemende intensiteit.
In een monochromator wordt alleen de eerste-orde diffractie (hetzij +1 of -1) gebruikt om de gewenste golflengte te selecteren en de hogere orden zijn ongewenst. Door het brede spectrum van golflengten die worden verstrooid, zijn de hoekbereiken die door de eerste- en tweede-ordediffractie worden ingenomen, echter niet uniek. Dit wordt geïllustreerd in figuur 1 waar de blauwe kegel het bereik van de hoeken waar het licht is eerste orde diffracted en de rode kegel het bereik van de hoeken waar het licht is diffracted tweede orde en er is een overlap regio gedeeld tussen deze bereiken vertegenwoordigt. Dit gedeelde bereik kan ook worden afgeleid uit de vergelijking van het traliewerk. Beschouw licht van 600 nm dat eerste orde verstrooid is (m = 1, λ = 600 nm) en licht van 300 nm dat tweede orde verstrooid is (m = 2, λ = 300); het is duidelijk dat het linkerlid van de roostervergelijking in beide gevallen hetzelfde is en dat de hoek van het verstrooide licht dus gelijk moet zijn. Het gevolg hiervan is dat wanneer de monochromator is ingesteld om 600 nm door te zenden, een kleine fractie van 300 nm licht ook zal worden doorgelaten, wat problematisch kan zijn voor fluorescentiespectroscopie.
De verschijning van tweede-ordeverschuiving in fluorescentiespectra
Tweede-ordediffractie is een bijzonder probleem voor verstrooiende monsters zoals poeders, kristallen en colloïdale suspensies. Om het effect van tweede-ordediffractie op fluorescentiespectra aan te tonen, werd een fluorescentieverstrooiend monster bereid door een oplossing van de fluorescente kleurstof 2-aminopyridine te mengen met Ludox, een colloïdale suspensie van silicananodeeltjes die als verstrooier fungeert. De oplossing werd geëxciteerd bij 300 nm en het emissiespectrum werd gemeten over een bereik van 250 nm tot 950 nm, zoals getoond in figuur 2, met behulp van de FLS1000 fotoluminescentiespectrometer met het ordersorteerfilter (zie volgend hoofdstuk) van de emissiemonochromator uitgeschakeld. De eerste piek bij 300 nm komt overeen met de Rayleigh-verstrooiing van het 300 nm excitatielicht dat door de eerste orde in de emissiemonochromator is verstrooid. Deze wordt gevolgd door de eerste-ordefluorescentie van het 1-aminopyridine, die bij 380 nm een piek vertoont. Deze pieken worden vervolgens herhaald als tweede-orde-artefacten met een Rayleigh-verstrooiingspiek bij 600 nm en een fluorescentiepiek bij 760 nm. Een zwakke derde-orde Rayleigh-verstrooiingspiek is ook nog net te zien bij 900 nm. Het verwarren van tweede-orde-artefacten met echte fluorescentie-emissie is een veelgemaakte fout bij onervaren fluorescentiegebruikers en is zelfs de oorzaak geweest van foutieve rapporten in de literatuur. Een voorbeeld hiervan is de publicatie van een artikel waarin nieuwe zwakke lange golflengte emissiebanden van tryptofaan en tyrosine bij 675 nm en 600 nm werden gerapporteerd die naast de bekende UV-emissie van deze eiwitresiduen kwamen.3 Zes maanden later publiceerden Hutnik et al. een weerlegging waaruit bleek dat de vermeende lange golf fluorescentie gewoon de tweede orde diffractie was van de echte tryptofaan en tyrosine UV-emissie bij 340 nm en 300 nm.4
Verwijdering van tweede-ordediffractie met behulp van ordersorteerfilters
Het verwisselen en publiceren van een tweede-orde-artefact is een extreem voorbeeld, maar een meer voorkomend probleem is dat de tweede-ordeverstrooiing vaak overlapt met de fluorescentie-emissie die wordt gemeten en het spectrum vervormt. Figuur 3a toont het emissiespectrum van hetzelfde Ludox / 2-aminopyrididemonster dat in figuur 2 is gebruikt, maar de excitatiegolflengte is verschoven naar 240 nm en het emissiebereik is verkleind. De tweede-ordeverstrooiing ligt nu bij 480 nm en overlapt met de staart van de fluorescentie van 2-aminopyridine, waardoor het spectrum niet nauwkeurig kan worden gemeten. Ordersorteerfilters zijn long pass filters die alleen golflengten doorlaten boven de afsnijgolflengte van het filter. Het principe van de filters voor het ordenen van de golflengten in de monochromator wordt geïllustreerd in figuur 4, waarin de filters voor het ordenen van de golflengten in een filterwiel zijn gemonteerd dat zich vóór de uittredingsopening bevindt. Wanneer de monochromator is ingesteld om 300 nm door te zenden, wordt de diffractierooster zo gedraaid dat het 300 nm verstrooide licht op de uittredingssleuf van de monochromator wordt gericht en wordt het filterwiel zo gedraaid dat er zich geen lang doorlaatfilter in de lichtweg bevindt en het 300 nm licht zoals gewenst door de monochromator wordt uitgestraald (linkerafbeelding). Wanneer de monochromator is ingesteld om 600 nm licht uit te zenden, wordt het diffractierooster zo gedraaid dat het eerste-orde verstrooide 600 nm licht op de uittredingsspleten wordt gericht, samen met een kleine hoeveelheid tweede-orde 300 nm licht. Het filterwiel wordt zo gedraaid dat er zich een 400 nm lang doorlaatfilter voor de uittredeopening bevindt die het gewenste 600 nm licht doorlaat terwijl het ongewenste 300 nm licht wordt tegengehouden (rechterafbeelding).
Het voordeel van ordeningsfilters is te zien in figuur 3b, waar het spectrum opnieuw is gemeten met het geautomatiseerde ordeningsfilterwiel van de emissiemonochromator van FLS1000 nu ingeschakeld. Het sorteerfilter verwijdert de tweede-ordeverstrooiingspiek bij 480 nm en het ware spectrum van 2-aminopyridine wordt verkregen. De Edinburgh Instruments FLS1000 en FS5 spectrometers zijn standaard uitgerust met filters voor het sorteren van de volgorde op zowel de excitatie als de emissie monochromatoren. Deze filterwielen zijn standaard ingeschakeld en zijn volledig geautomatiseerd, waarbij de Fluoracle® software van de FLS1000 en FS5 de juiste filters selecteert om te gebruiken op basis van de keuze van excitatiegolflengte en emissiegolflengte. Met deze automatische filterwielen kan de gebruiker brede fluorescentiespectra meten zonder zich ooit zorgen te hoeven maken over tweede-orde-artefacten die de metingen verstoren.
We hopen dat deze blogpost u heeft geholpen de aanwezigheid van tweede-orde-artefacten in fluorescentiespectra te begrijpen en hoe deze kunnen worden vermeden door gebruik te maken van ordeningsfilters.
- Introduction to Fluorescence, D. M. Jameson, CRC Press (2014)
- Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd, J. R. Lakowicz, Springer (2006)
- Macías, M. C. Pinto, C. Gutiérrez-Mérino, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan Solutions, Biochem Int. 15, 961-969 (1987)
- M. Hutnik, A. G. Szabo, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan: a Classic Example of Second Order Diffraction, Biochem Int. 16, 587-591 (1988)
Spectrometers voor het voorkomen van Second Order Diffraction
De FS5 en FLS1000 spectrometers zetten de standaard in steady state en tijdsgeresolveerde fotoluminescentie spectroscopie voor zowel fundamenteel onderzoek als routinematige laboratoriumtoepassingen. Voor meer informatie over onze FLS1000 en FS5 kunt u contact opnemen met een lid van ons team op [email protected].
Keep in touch
Als u genoten heeft van deze blog post, en u wilt de eerste zijn om al het laatste nieuws, toepassingen en productinformatie te zien, meld u dan aan voor onze nieuwsbrief via de rode sign-up knop hieronder, en volg ons op social media.