Targeting a moonlighting function of aldolase induces apoptosis in cancer cells

Sinds Otto Warburg ontdekte dat kankercellen een extreem hoge snelheid van glucose-opname en lactaatproductie1 vertonen, heeft een veelheid van studies aangetoond dat de meerderheid van de kankercellen afhankelijk zijn van glycolytische energieproductie2. Dit heeft laboratoria wereldwijd gestimuleerd om te zoeken naar remmers van de glycolyse als potentiële geneesmiddelen tegen kanker.

Het biologische belang van de zeer hoge expressie van glycolytische enzymen in kankercellen is echter raadselachtig. Het eerste enzym van de glycolyse, hexokinase, komt in vergelijking met de daaropvolgende enzymen3 op een lager niveau tot expressie, en heeft een relatief lage specifieke activiteit en affiniteit voor substraten4,5. De totale activiteit ervan beperkt dus de flux door de glycolyse. De overvloed aan glycolytische enzymen in kankercellen kan dus geen sneller glucose katabolisme bevorderen, maar moet geassocieerd zijn met andere, niet-katalytische processen.

Glycolytische enzymen behoren tot de moonlighting enzymen6,7 waarvan de fysiologische rol niet beperkt is tot katalytische functie en die kunnen optreden als regulatoren van een verscheidenheid aan cellulaire processen. Wij presenteren bewijs dat een glycolytisch enzym, aldolase, een krachtig doelwit kan zijn voor anti-kanker therapie en dat de verstoring van een complex web van intracellulaire interacties die door het enzym gemedieerd worden, van cruciaal belang is voor de anti-kanker werking.

Aldolase bevindt zich halverwege de glycolytische route en katalyseert de omkeerbare splitsing van fructose-1,6-bisfosfaat (FBP) in dihydroxyaceton-3-fosfaat en glyceraldehyde-3-fosfaat. De spierisovorm (ALDOA), die de meest voorkomende aldolase isovorm in bijna alle kankers8 is, kan actinefilamenten9,10 organiseren, activiteiten van AMPK11,12 en FBP213 beïnvloeden, en Wnt14,15 en p53 signalering16 reguleren. Er is ook aangetoond dat ALDOA betrokken is bij de voortgang van de S/G1-fase van de celcyclus17. Aangezien ALDOA deelneemt aan vele cellulaire gebeurtenissen die noodzakelijk zijn voor de overleving en proliferatie van kankercellen, veronderstelden wij dat verstoring van de maanlichtfuncties van ALDOA een geschikt doelwit zou kunnen vormen voor anti-kankertherapie.

Onze resultaten tonen aan dat in kankercellen, maar niet in normale cellen, de verstoring van de ALDOA interactie met het actine cytoskelet een opeenvolging van intracellulaire veranderingen teweegbrengt, waaronder een aanzienlijke verhoging van de ROS produktie, stopzetting van de ATP synthese en verhoging van het calcium gehalte, die resulteren in caspase activering en blokkade van de cellulaire proliferatie. Aangezien het mechanisme van deze veranderingen onafhankelijk is van de katalytische functie van ALDOA, concluderen wij dat de overexpressie van ALDOA in kankercellen niet gerelateerd is aan hun hoge glycolytische vereisten, maar een aanpassing vertegenwoordigt waarmee metastatische kankercellen de integriteit van hun actine cytoskelet verzekeren terwijl ze de epitheliale-mesenchymale overgang ondergaan.

UM0112176 – een nieuwe ALDOA-remmer – vermindert de groei van kankercellen aanzienlijk

Om de ALDOA interactie met zijn bindingspartners te verstoren, gebruikten we een langzaam bindende gemengde remmer van ALDOA (UM0112176; Supplementary Fig. S1a) die we vonden door high-throughput screening van de grote samenstellingenbibliotheek aan de Universiteit van Montreal. UM0112176 remde menselijke ALDOA activiteit met IC50 ∼ 2-5 uM in een langzame binding manier (Supplementary Fig. S1b, c), zonder remming van andere glycolytische enzymen (Supplementary Fig. S1d). Wij controleerden het vermogen van UM0112176 om ALDOA activiteit in vivo te remmen door het bepalen van cellulaire niveaus van fructose-1,6-bisfosfaat en triosefosfaten na 24-uurs incubatie van cellen in de aanwezigheid van de remmer (Supplementary Fig. S1e). De resultaten toonden een significante toename van de titer van ALDOA-substraat en een sterke afname van ALDOA-reactieproducten, zowel in kankercellen (KLN205, long squameuze kanker bij muizen) als in normale cellen (primaire cultuur van astrocyten bij ratten). Dit wordt ondersteund door de waargenomen omgekeerde trend bij gebruik van glutamine-only celkweekmedia.

Volgende, wij bepaalden een dosis-respons curve van UM0112176 en ontdekten dat 10 µM UM0112176 de groei van alle geteste kanker cellijnen sterk verminderde: KLN205, hNSCLC (menselijke niet-kleincellige longkanker cellijn), BxPC3 (humaan pancreas adenocarcinoom) en AsPC1 (humaan pancreas adenocarcinoom ascites metastase) (Fig. 1a). De groeisnelheid van normale cellijnen (rat astrocyten, muis cardiomyocyten-HL-1 cellijn, en een menselijke epitheliale cellijn-ME16C) werd praktisch niet beïnvloed door 10 µM UM0112176 (Fig. 1a). Bij een langdurige 7-daagse behandeling met 10 µM UM0112176 werd het aantal kankercellen verviervoudigd, terwijl het aantal normale cellen slechts met 25-30% daalde (Fig. 1b).

Om te onderscheiden of de remming van de celgroei te wijten was aan een verhoogde mortaliteit of aan een blokkering van de proliferatie, hebben we de celexpressie van Ki67 (een marker van celproliferatie) en actieve caspase (caspase 3, de laatste effector in apoptose) bepaald. De resultaten toonden aan dat in kankercellen, 10 µM UM0112176 (24 uur behandeling) het Ki67-gerelateerde fluorescentiesignaal sterk verminderde (Fig. 1c) en de aanwezigheid van actieve caspase verhoogde (Fig. 1d). In normale cellen werden geen veranderingen waargenomen (Fig. 1d), zelfs niet na 48-uurs behandeling (Supplementary Fig. S2a).

UM0112176 behandeling verstoort actine cytoskelet en verandert ROS, mitochondriale membraanpotentiaal, Ca2+, DSB, en ATP niveaus in kankercellen maar niet normale cellen

Om het mechanisme van UM0112176 actie op te helderen onderzochten we een aantal cellulaire activiteiten die mogelijk door de remmer worden beïnvloed, waaronder de morfologie van het cytoskelet, de ATP-concentratie, het gehalte aan reactieve zuurstofspecies (ROS), het mitochondriaal membraanpotentiaal en dubbelstrengs DNA-breuken (DSB’s). De meest uitgesproken manifestatie van de werking van de remmer was een volledige verdwijning van F-actine stressvezels in kanker- maar niet in normale cellen na 24 uur incubatie met de remmer (Fig. 1e). Intrigerend is dat het begin van de verstoring van polymere actine veel sneller was (<5 min) (Supplementary Fig. S3a) dan volledige remming van ALDOA in vitro (∼15 min). Dit ondersteunt de hypothese dat F-actine depolymerisatie niet afhankelijk is van de remming van ALDOA activiteit.

Gelijktijdig met de verstoring van het cytoskelet, observeerden wij een significante verhoging van ROS en calcium niveaus, een daling van de ATP concentratie en van de mitochondriale membraanpotentiaal, alsmede de inductie van dubbelstrengs DNA breuken (Fig. 2a-e). Belangrijk is dat de door UM0112176 veroorzaakte veranderingen in kankercellen niet werden doorgegeven (bv. door het vrijkomen van ROS) aan normale cellen: Behandeling met UM0112176 van KLN205-cellen in co-cultuur met normale menselijke fibroblasten verhoogde alleen de ROS-niveaus in kankercellen (aanvullende Fig. S3b).

UM0112176-geïnduceerde veranderingen kunnen niet worden verklaard door remming van de glycolyse

Om verder te onderzoeken of UM0112176-geïnduceerde veranderingen kunnen worden gereproduceerd door remming van de glycolyse in kankercellen, testten we de invloed van andere glycolytische enzymen effectoren: alizarinerood S dat fosfoglyceraat mutase (PGAM)18 remt en 3-PO ((2E)-3-(3-pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-propen-1-one) dat indirect de werking van 6-fosfofructo-2-kinase/fructose-bisfosfatase-2 (PFK-2)19 blokkeert. Remming van PGAM resulteerde in een toename van ROS (Supplementary Fig. S4a) zonder effect op cytoplasmatisch calcium niveau, terwijl remming van PFK-2 verhoogde cytoplasmatische Ca 2 + niveaus zonder veranderingen in ROS (Supplementary Fig. S4a, b). Bovendien waren zelfs snel prolifererende kankercellen (KLN205) in staat om een constant niveau van totaal ATP te handhaven (Supplementair Fig. S4c, d) in aanwezigheid van deze remmers, vermoedelijk door gebruik te maken van andere voedingsstoffen zoals glutamine in plaats van de glucose-opname te activeren. Belangrijk is dat noch 3-PO noch Alizarin Red S het F-actine cytoskelet verstoorde of DSB’s induceerde (gegevens niet weergegeven).

UM0112176 verstoort ALDOA-actine interacties

Aldolase staat bekend om interactie met actine en actine-bindende eiwitten 8,9, waardoor de dynamiek van het cytoskelet wordt beïnvloed. Het kan WASP-afhankelijke actinepolymerisatie remmen14 en leiden tot cytokinese defect20 maar kan ook actine-afhankelijke processen bevorderen zoals kankercel motiliteit verworven in de EMT overgang21. Deze complexe rol van ALDOA roept de hypothese op dat binding van UM0112176 aan ALDOA verantwoordelijk kan zijn voor de waargenomen verstoring van het F-actine cytoskelet.

De verstoring van het cytoskelet is echter actine isovorm-specifiek als UM0112176 gedeeltelijk verstoord de vereniging van ALDOA met de fibrillaire vorm van cytoskeletactine die β en γ isovormen (Fig. 3a), terwijl het geen effect op de stabiliteit van de spier (α isomeer) actine polymeren (gegevens niet weergegeven). In F-actine-aldolase rafts worden F-actine contacten met aldolase voornamelijk gevonden in twee loci; de regio van residuen 1-8 en residuen 350-36522. Antigenische sondes vonden nauwe bindingsplaatsen voor aldolase in geconserveerde C-terminale regio’s van α-actine microfilamenten23. Een Brownian dynamics simulatie vond vergelijkbare actine residuen die deelnemen aan aldolase binding24. Aangezien verschillen in residuen 1-8 de actine-isovormen onderscheiden25, is de actine N-terminale regio dus de drijvende kracht achter de isovormspecifieke binding met aldolase. Er is ook aangetoond dat ALDOA bij voorkeur interageert met de γ-actine in cellulaire pulldowns van longkankercellysaten26 , wat bevestigt dat ALDOA-contact met de actine-N-terminale regio onderscheid maakt tussen de actine-isovormen.

Interessant is dat de bindingsplaats van ALDOA overlapt met de bindingsplaats van cofiline op actine27,28, een eiwit waarvan bekend is dat het de depolymerisatie van actinevezels versnelt29 , en waarvan de binding overlappende N- en C-terminale actineresiduen impliceert30. Gezien de grote bolvormen van ALDOA en cofiline, wijst de grote overlap in actinebindingsplaatsen op concurrentie tussen ALDOA en cofiline voor dezelfde bindingsloci op actine. De incubatie van F-actine (β-γ isovormen) met zowel ALDOA als cofiline (in equimolaire subunit concentraties) toonde weinig effect van cofiline op de stabiliteit van F-actine (Fig. 3b), wat aangeeft dat ALDOA F-actine beschermde tegen cofiline actie. Dit is consistent met de nauwere verwachte binding van ALDOA aan F-actine23 dan cofiline, dat een geschatte dissociatieconstante van ∼10 μM31 heeft. De in vitro bescherming door ALDOA tegen de cofiline-gemedieerde depolymerisatie van actine werd opgeheven met de toevoeging van UM0112176 (Fig. 3b). Hoewel ALDOA in vitro met cofiline kon interageren, vonden wij geen aanwijzingen dat UM0112176 deze interactie kon verstoren (Supplementary Fig. S2b). De destabilisatie van het F-actine cytoskelet door UM0112176 moet dus het gevolg zijn van dissociatie van ALDOA van zijn bindingsloci op F-actine die overlappen met de cofiline bindingsloci, waardoor cofiline zich aan F-actine kan hechten en de depolymerisatie ervan kan bewerkstelligen. In lijn hiermee zagen we de afwezigheid van colokalisatie van cytoskeletactine en ALDOA in KLN205 cellen behandeld met UM0112176 (Fig. 3c).

Om de interactie van UM0112176 met ALDOA (PDB: 1ZAJ) te onderzoeken werd een blinde moleculaire docking analyse uitgevoerd. Berekeningen met behulp van AutoDock32 toonden 1 major en 2 minor pose clusters voor UM0112176 op ALDOA. De major cluster bevatte 17 poses met voorspelde bindingsenergie rond ∼9.2 kcal/mole terwijl de minor cluster elk 3 poses had met iets lagere bindingsenergie. Visuele inspectie plaatst de bovenste pose vicinaal aan Lys-293 en Cys-338 (Fig. 3d) waardoor hun rotameren een waterstofbrug kunnen vormen met respectievelijk de -C≡N en -Cl functionele groepen van UM0112176. Modificatie van Cys-72 en Cys-338 door hun crosslinking33 of door geoxideerd glutathion remt de katalytische activiteit34 door communicatie over lange afstanden met de actieve site op ~25Å afstand. Lange-afstand remming van dynamische gebeurtenissen tijdens de katalyse die nodig zijn voor ALDOA activiteit door UM0112176, zoals werd aangetoond voor geoxideerde glutathion inactivatie van ALDOA34, is in overeenstemming met de remmingskinetiek. Intrigerend is dat is aangetoond dat Lys-293 de interactie tussen γ-actine en ALDOA bevordert, aangezien de K293A-mutatie de binding verbreekt26. Bovendien overlappen de residuen die de bindingsholte van UM0112176 vormen met de residuen die zijn aangetoond voor raltegravir op ALDOA, en behandeling met raltegravir (100 μM) verlengde de overlevingskans van muizen ∼2-voudig ten opzichte van de controlegroep26 in een orthotopisch longkankermodel. Wij stellen de hypothese dat UM0112176 het vermogen om ALDOA te dissociëren van β/γ-actine benut door te concurreren met γ-actine voor de interactie met Lys-293 op ALDOA.

Deze bevinding verklaart echter niet de afwezigheid van UM0112176 actie op cytoskeletale actine in normale cellen. Het is duidelijk dat in normale cellen andere actine-geassocieerde eiwitten het cytoskelet moeten beschermen tegen de cofiline-geïnduceerde depolymerisatie, maar in kankercellen is deze bescherming blijkbaar gebrekkig. Daarom zochten wij naar kankerspecifieke factoren die de depolymerisatie van het F-actine cytoskelet zouden kunnen versnellen en in staat zouden zijn apoptose te induceren. Wij stelden vast dat één van de prominente cellulaire effecten van UM0112176 toepassing een zeer snelle intensivering van de ROS produktie was, die uitsluitend in kankercellen optrad (Fig. 2a). Aangezien de toename van ROS niveaus samenviel met de modulatie van de F-actine vezelstructuur35, richtten we ons op cytoskelet-geassocieerde bronnen van ROS die mogelijk specifiek zijn voor kankercellen.

Stijging van ROS niveaus na UM0112176 behandeling wordt voornamelijk veroorzaakt door NOX activiteit

NADPH-afhankelijk oxidase (NOX) is een belangrijke bron van intracellulaire ROS die kan worden gereguleerd door het actine-cytoskelet36. Er is aangetoond dat NOX1 deelneemt aan de epitheliale-mesenchymale transitie, een proces dat de invasie van kankercellen vergemakkelijkt37. Wij stelden bijgevolg de hypothese voorop dat de door UM0112176 geïnduceerde verplaatsing van ALDOA van gepolymeriseerd actine een door cofiline geleide destabilisatie van het cytoskelet mogelijk maakte en dat de daaruit voortvloeiende depolymerisatie verantwoordelijk zou kunnen zijn voor de toename van ROS. Intrigerend is dat in de meeste kankercellen NOX-eiwitten (vooral NOX1 isovorm) op een hoger niveau tot expressie komen dan in normale cellen38 (Supplementary Fig. S2c). Daarom hebben we de expressie van NOX1 in kankercellen uitgeschakeld (Fig. 3h) of de activiteit van NOX1 geremd met apocynine39. De resulterende vermindering van de NOX1-activiteit en -expressie blokkeerde de door UM0112176 veroorzaakte verhoging van de ROS-niveaus (Fig. 3e-g).

Dit actine-afhankelijke mechanisme van ROS-productie suggereert dat UM0112176 door het stimuleren van de verplaatsing van ALDOA van actinefilamenten cofiline in staat stelt actinefilamenten te depolymeriseren en zo NOX te activeren. De ROS-productie door geactiveerd NOX maakt op zijn beurt redox-activatie van slingshot homolog 1 mogelijk om P-cofiline te defosforyleren40. Inderdaad, de toevoeging van UM0112176 verminderde cellulaire P-cofiline niveaus (Supplementary Fig. S5a). ALDOA losgekoppeld van actine filamenten door UM0112176 actie bevordert hun verdere depolymerisatie door het vrijgeven van extra bindingsplaatsen voor gefosforyleerd cofiline te binden met de filamenten. Dit feed-forward mechanisme zou de snelle depolymerisatie van actine verklaren die werd waargenomen in KLN205 en hNSCLC cellen.

Verrassend genoeg stopte apocynine slechts gedeeltelijk de door UM0112176 veroorzaakte stijging van het cytoplasmatisch calciumniveau en het bood geen bescherming tegen activering door caspase 3 (Fig. 3i, j). Hoewel apocynine blijkbaar de verstoring van actinefilamenten door UM0112176 remde, leek het cytoskelet meer gebundeld in vergelijking met onbehandelde cellen, en de cellen vertoonden een veranderde morfologie wanneer ze gelijktijdig werden behandeld met apocynine en UM0112176 (Fig. 3k). De verstoring van het cytoskelet door ofwel UM0112176 of in combinatie met apocynine is consistent met NOX1-afhankelijke ROS-productie voor een goede cytoskeletorganisatie in deze kankercellen.

Cellulair mechanisme van UM0112176-werking betreft mitoKATP-opening

Een eiwit dat mogelijk het actine-cytoskelet zou kunnen verbinden met mitochondriale ROS-productie en apoptose is het mitochondriale ATP-afhankelijke kaliumkanaal (mitoKATP). Een verband tussen intracellulaire K+ concentratie en apoptose is in vele systemen gedocumenteerd en mitoKATP41 is hierbij betrokken. Het kanaal blijkt gevoelig te zijn voor depolymerisatie van actine waardoor het kanaal zich sneller opent42,43 en resulteert in een milde ontkoppeling en toename van de mitochondriale ROS-productie44. Er is echter controverse in de literatuur, met sommige resultaten suggereren dat eerder actine verstoring sluit mitoKATP45.

We voorbehandeld kankercellen met 5HD (5-Hydroxydecanoaat), waarvan bekend is dat blokkeren opening van mitoKATP44, en we zagen dat 5HD aanzienlijk verminderde de UM0112176-geïnduceerde toename van ROS (Fig. 4a). 5HD voorbehandeling was niet in staat om de actine cytoskelet verstoring (Fig. 4b) en de inductie van apoptose door UM0112176 te blokkeren, hoewel het de snelheid van caspase 3 activering aanzienlijk vertraagde (Fig. 4c). De door UM0112176 veroorzaakte depolymerisatie van actine in het cytoskelet kan dus verantwoordelijk zijn voor de productie van ROS, zowel door de opening van het mitoKATP als, onafhankelijk daarvan, door de activering van NOX1, die op zijn beurt de verstoring van het cytoskelet versterkt.

De omgekeerde modus van de natrium-calcium wisselaar is verantwoordelijk voor UM0112176-geïnduceerde calcium influx

UM0112176 binding aan ALDOA werd ook geassocieerd met een significante stijging van cellulaire calcium niveau in kanker, maar niet in normale cellen (Fig. 2b). Deze stijging was sneller in KLN205 (<5 min) dan in hNSCLC cellen (~20 min) (Fig. S4g). Daarom zochten we naar de oorsprong van dit calcium en vonden dat het afkomstig was van de extracellulaire opslag (Fig. 4d, e). Depletie van Ca2+ uit het kweekmedium verhinderde de door UM0112176 geïnduceerde toename van cellulair calcium.

We vroegen ons vervolgens af of NOX1 en mitoKATP synergetisch de veranderingen van het intracellulaire vrije Ca2+-niveau zouden kunnen reguleren. Inderdaad, remming van NOX1 beschermde gedeeltelijk tegen UM0112176-geïnduceerde Ca2+ verhoging (Fig. 3i), terwijl remming van mitoKATP opening de verhoging vrijwel opheft (Fig. 4f, g). Aangezien geen van beide eiwitten als calciumkanaal of -wisselaar fungeert, moeten ze fungeren als regulatoren (bijv. via ROS) van eiwitten die direct betrokken zijn bij de calciumhomeostase.

De activering van NOX kan leiden tot mitoKATP-opening, die op zijn beurt indirect de omgekeerde modus van de natrium-calciumwisselaar (NCXrev) kan stimuleren, waardoor de instroom van Ca2+ in de cellen wordt bevorderd.46 Daarom testten wij een mogelijke betrokkenheid van NCX in de door UM0112176 geïnduceerde toename van calcium. Remming van NCXrev door KB-R794346 verminderde inderdaad de instroom van calcium (Fig. 4h). Dit heeft echter niet voorkomen dat de inductie van apoptose (Supplementary Fig. S5b).

Het is aangetoond dat actine depolymerisatie stimuleert de NCXrev activiteit47 die verdere steun verleent voor NCX als de wisselaar die verantwoordelijk is voor Ca 2 + influx bij UM0112176 toevoeging.

Daaruit kan worden geconcludeerd dat de crosstalk tussen NOX en mitochondriale ROS48 membraantransporters, natrium-waterstofwisselaar en natrium/bicarbonaat cotransporter activeert via de stimulatie van de ROS-gevoelige MAPK cascade en culmineert in Ca2+ influx via NCXrev49. Bovendien activeert cytoplasmatische Ca2+ overbelasting NOX50 en mitochondriale Ca2+ belasting via de mitochondriale calcium uniporter versnelt de mitochondriale ROS productie51, waardoor een positieve feed-back loop ontstaat die hoge ROS en calciumniveaus handhaaft en apoptose induceert. De onderdrukking van de Ca2+ influx door remming van de NCXrev (Fig. 4h) ondersteunt de opvatting dat de opening van mitoKATP die leidt tot mitoROS afgifte in het cytoplasma52 de cruciale gebeurtenis verantwoordelijk voor apoptose vormt.

Kankercel-specifieke daling van het ATP-niveau bij remming van ALDOA induceert een snelle dissociatie van HK2 van de mitochondriën

Hoewel UM0112176 de ATP-synthese in alle cellijnen remde, waren de ATP-veranderingen groter en sneller in kankercellen (Fig. 2c). Belangrijk is dat in normale cellen, maar niet in kankercellen, deze veranderingen omkeerbaar waren bij het terugtrekken van de remmer (Supplementary Fig. S4e). De toevoeging van UM0112176 induceerde een snelle daling (<5 min) in ATP niveaus in KLN205 (∼40% daling) en hNSCLC (∼20% daling) cellen (Supplementary Fig. S4f), terwijl geen dergelijke veranderingen werden waargenomen in normale cellen (Supplementary Fig. S4f).

Deze bifasische kinetiek van UM0112176-geïnduceerde ATP-depletie riep de vraag op naar het mechanisme dat verantwoordelijk is voor de snelle daling van ATP niveaus in kankercellen. Daarom onderzochten wij de subcellulaire lokalisatie van hexokinase 2 (HK2), waarvan de expressie verhoogd is in de meeste kankercellen en dat associatie met mitochondriën vereist voor volledige activiteit en efficiënte ATP synthese door mitochondriën4,5. We zagen dat in kanker, maar niet in normale cellen, HK2 gedissocieerd snel van mitochondriën na UM0112176 behandeling (Fig. 4i) en de tijdspanne van deze veranderingen was gecorreleerd met de tijdschaal van ROS productie. Dus, in snel prolifererende kankercellen, de eerste fase van de UM0112176-afhankelijke daling van ATP niveaus correleert met de snelle dissociatie van HK2 van mitochondriën.

Het stilleggen van ALDOA expressie (Supplementary Fig. S5c) recapituleerde de waarnemingen geïnduceerd door UM0112176 behandeling (Supplementary Fig. S5d-f) en toonde geen gelijktijdige daling van ATP niveaus, in overeenstemming met de resultaten gerapporteerd door Lew en Tolan14,20. Dit wijst erop dat de waargenomen daling van het ATP-niveau niet het gevolg is van een lagere metabolische activiteit, maar het gevolg is van maanlichtinteracties van ALDOA met zijn bindingspartners die door UM0112176 worden opgeheven. Chang et al. wezen erop dat de ALDOA-mutatie van K293A de ALDOA-interactie met γ-actine beïnvloedt, maar geen veranderingen in de glycolytische flux met zich meebrengt26 , wat onze interpretatie ondersteunt dat UM0112176 ingrijpt in de ‘moonlighting’ interacties van ALDOA.

Het effect van UM0112176 op kankercellen kan niet worden verklaard door FBP-accumulatie

Om na te gaan of de waargenomen veranderingen verband houden met de niet-metabolische functie van ALDOA of dat ze gevolgen zijn van de remming van de enzymactiviteit en dus van de accumulatie van FBP, onderzochten we het effect van FBP op het ROS- en ATP-niveau en op de cytoskeletstructuur. Hoewel de efficiëntie van transmembraandiffusie van FBP relatief laag is, kan het actief en effectief getransporteerd worden door verschillende cellen53,54. Wij stelden vast dat 20 mM maar niet 5 mM extracellulaire FBP de ROS productie stimuleerde en de cytoskelet structuur destabiliseerde in kankercellen (Supplementaire Fig. S3c, d) hetgeen consistent is met de lange afstand communicatie tussen de aldolase actieve site en UM0112176 bindings locus. Dezelfde FBP concentraties hadden slechts een gering effect op normale cellen (Supplementary Fig. S3c, d), weerspiegelen de trend waargenomen voor cellulaire behandeling met UM0112176. Het gebrek aan waarneembare veranderingen in astrocyten komt overeen met de virtuele afwezigheid van NOX1 in deze cellen (supplementaire fig. S2c) en versterkt het belang van ROS-productie door NOX1 in kankercellen voor een goede cytoskeletale organisatie. Hoewel de aanwezigheid van lage niveaus van NOX1 in normale cellen die geen apoptose ondergaan wanneer ze met UM0112176 worden behandeld, zou kunnen pleiten tegen de selectiviteit van NOX1 voor kankercellen tijdens de behandeling met UM0112176, werd aangetoond dat kweekmedia met lage glucose (5 mM) verhinderden dat de NOX4-isovorm zich op lipide vlotten in adipocyten richtte, waardoor ze in een laagactieve membraanfractie bleef55. Aangezien onze celkweekexperimenten werden uitgevoerd met glucoseconcentraties die de fysiologische omgeving (5 mM) nabootsen, dient de aanwezigheid van NOX1 in normale cellen waarschijnlijk een andere niet-cytoskeletale functie.

UM0112176 voorkomt nucleaire lokalisatie van ALDOA

Onverwacht resulteerde de behandeling met UM0112176 ook in de depletie van ALDOA uit de kernen van kankercellen (Supplementaire Fig. S5g). Nucleaire ALDOA lokalisatie is aangetoond te worden geassocieerd met celcyclus progressie17, echter, het mechanisme van ALDOA nucleaire transport en de betekenis ervan voor regulering van de celcyclus vereist verdere studies.