Ultraviolet-zichtbaar, of UV-Vis, spectroscopie is een van de populairste analysetechnieken in het laboratorium.
Bij UV-Vis spectroscopie wordt licht door een monster gestuurd bij een specifieke golflengte in het UV- of zichtbare spectrum. Als het monster een deel van het licht absorbeert, zal niet al het licht worden doorgelaten, of worden doorgelaten. Transmissie is de verhouding tussen de intensiteit van het doorgelaten licht en het invallende licht, en is gecorreleerd met absorptie. De extinctie kan op kwantitatieve wijze worden gebruikt, om de concentratie van een monster te verkrijgen. Het kan ook op een kwalitatieve manier worden gebruikt, om een verbinding te identificeren door de gemeten extinctie over een reeks golflengten, het zogenaamde absorptiespectrum, te vergelijken met de gepubliceerde gegevens. Deze video introduceert UV-Vis spectroscopie, en demonstreert het gebruik ervan in het laboratorium bij het bepalen van monsterconcentratie en reactiekinetiek.
Wanneer een foton een molecuul raakt en wordt geabsorbeerd, gaat het molecuul van zijn grondtoestand over in een hogere energietoestand. Het energieverschil tussen deze twee toestanden is de bandkloof. De energie van het foton moet precies overeenkomen met de bandkloof, wil het foton geabsorbeerd worden. De chemische structuur bepaalt de bandkloof; daarom hebben moleculen elk unieke absorptiespectra.
Absorbantie volgt de Wet van Beer, die zegt dat absorptie gelijk is aan de molaire verzwakkingscoëfficiënt maal de padlengte en de concentratie. De molaire verzwakkingscoëfficiënt is gerelateerd aan het vermogen van de individuele verbinding om licht van een specifieke golflengte te absorberen. De weglengte is de afstand die het licht door het monster aflegt, die voor standaardcuvetten meestal 1 cm bedraagt. De wet van Beer kan worden gebruikt om de monsterconcentratie te berekenen, als het absorptievermogen bekend is, of er kan een kalibratiecurve worden gebruikt.
UV-Vis wordt vaak een algemene techniek genoemd, omdat de meeste moleculen licht absorberen in het UV-zichtbare golflengtegebied. Het UV-bereik strekt zich uit van 100-400 nm, en het zichtbare spectrum van 400-700 nm. De meeste spectrofotometers werken echter niet in het diepe UV-bereik van 100-200 nm, omdat lichtbronnen in dit bereik duur zijn. De meeste UV-Vis-spectrofotometers gebruiken een deuteriumlamp voor het UV-bereik, die licht produceert van 170-375 nm, en een wolfraam gloeilamp voor het zichtbare bereik, die licht produceert van 350-2.500 nm.
Omdat de lichtbron gewoonlijk een lamp is met een breed golflengtebereik, wordt de specifieke extinctiegolflengte geselecteerd met behulp van filters of een monochromator. Een monochromator is een apparaat dat de golflengten van het licht ruimtelijk scheidt, en vervolgens een uitgangsspleet plaatst waar de gewenste golflengte van het licht is. De monochromator kan over een golflengtebereik worden gescand om een volledig absorptiespectrum te verkrijgen. Dit maakt de techniek nuttig voor het kwantificeren en identificeren van een breed scala van moleculen.
Nu de grondbeginselen van UV-Vis spectroscopie zijn geschetst, laten we eens kijken naar een eenvoudig UV-Vis experiment in het laboratorium.
Voordat met de meting wordt begonnen, moet de spectrofotometer worden aangezet, en moeten de lampen een geschikte tijd worden opgewarmd om ze te stabiliseren.
Voorbereid een blanco door het vullen van een schone cuvet met het monster oplosmiddel, en veeg vervolgens de buitenkant met pluisvrij papier om eventuele vingerafdrukken te verwijderen.
Zorg ervoor dat de cuvet goed is uitgelijnd met eventuele gegroefde zijden uit de bundel-pad, en plaats het in de spectrofotometer. Zet het deksel vast om te voorkomen dat omgevingslicht het systeem binnendringt.
Met de extinctie van de blanco bij één golflengte, of over een golflengtebereik. Noteer of bewaar de extinctie, want deze moet worden afgetrokken van de extinctie van het monster.
Daarna gooit u de blanco weg en spoelt u de cuvet tweemaal met monster. Vul vervolgens de cuvet voor ongeveer ¾ met monster. Veeg de buitenkant van de cuvet nogmaals af, zodat deze schoon is en vrij van vingerafdrukken.
Plaats de cuvet in de spectrofotometer in de juiste oriëntatie, en bevestig het deksel.
Volg een extinctie meting of spectrum bij dezelfde golflengte of golflengtegebied als de blanco. Trek het blanco spectrum of de blanco meting af, als het instrument dit niet automatisch doet.
Van het verzamelde absorptiespectrum bepaalt u het absorptiemaximum, of λmax.
Om de hoeveelheid analyt in het monster te kwantificeren, maakt u een ijkcurve met behulp van een reeks bekende concentraties van de analyt. Voor meer informatie over het construeren en gebruiken van een ijkcurve, bekijk de video “ijkcurves” uit deze collectie.
De absorptiemeting kan ook worden gebruikt om de reactiekinetiek te berekenen door de toe- of afname van de concentratie van een verbinding tijdens de reactie te meten. Begin met een eerste meting van het monster, blauwe kleurstof in dit geval, op het absorptiemaximum vóór de reactie.
Volgende, voeg snel het reagens toe, bleekwater in dit geval, om de chemische reactie te starten. Roer het goed door, zodat het zich mengt met het monster.
Met de tijd de extinctie op het absorptiemaximum meten.
Het aanvankelijke absorptiespectrum van het blauwe kleurstofmonster wordt getoond. De achtergrondkleuren tonen de kleuren van het licht in het zichtbare spectrum. De blauwe kleurstof heeft een absorptiemaximum bij ongeveer 630 nm.
De kinetiek van de reactie tussen blauwe kleurstof en bleekwater is in de tijd gemeten. De extinctie van de blauwe kleurstof neemt in de loop van de tijd af, naarmate deze met het bleekmiddel reageert. De extinctie bereikt bijna nul na 300 s, wat aangeeft dat de reactie bijna is voltooid. Voor meer informatie over kinetica en reacties, bekijk de JoVE Science Education video “Reaction Rate Laws”.
UV-Vis spectroscopie wordt veel gebruikt in veel verschillende onderzoeksgebieden om een monster te identificeren of te kwantificeren.
Vis spectroscopie wordt bijvoorbeeld veel gebruikt in biologische gebieden om de hoeveelheid eiwit in een monster te kwantificeren. Een Bradford-test wordt vaak gebruikt om eiwitten te kwantificeren, met behulp van een kleurstof. Eerst wordt een kalibratiecurve van bekende eiwitconcentraties gemaakt, meestal met boviene serumalbumine (BSA). Vervolgens wordt aan elk van de standaarden en aan het monster een coomassieblauwe kleurstof toegevoegd. De extinctie van het eiwit-kleurstofcomplex wordt dan gemeten bij 595 nm.
Als alternatief kunnen eiwitten direct worden gemeten door hun extinctie bij 280 nm. In dit voorbeeld wordt de eiwitconcentratie gekwantificeerd met behulp van een ultra-laag volume spectrofotometer. Voor veel eiwitten komt een extinctie van 1 overeen met een concentratie van 1 mg/mL.
UV-Vis spectroscopie wordt ook gebruikt om de hoeveelheid bacteriële cellen in een celcultuur te kwantificeren. Bij deze meting wordt de extinctie, of optische dichtheid, gemeten bij 600 nm. Een OD600-meting van 1 wijst doorgaans op de aanwezigheid van 8 x 108 bacteriecellen per ml. Door de celdichtheid tijdens de groei van de cultuur te meten, kan de bacteriële groeicurve worden bepaald en kan worden vastgesteld wanneer een cultuur zich in de exponentiële groeifase bevindt.
Stikstofoxide en stikstofdioxide, of NOx, is een bijproduct van uitlaatgassen van auto’s en kan schadelijk zijn voor het milieu omdat het schadelijke troposferische ozon vormt. NOx kan worden gemeten door het te laten reageren met een oplossing van sulfanilzuur en napthyl-ethyleendiamine. De resulterende oplossing is een roze gekleurd azo-kleurstofmolecuul, waarvan de intensiteit rechtstreeks gecorreleerd is met de NOx-concentratie. Deze concentratie kan vervolgens worden bepaald met behulp van een UV-Vis-spectrofotometer.
Je hebt zojuist JoVE’s inleiding tot UV-zichtbaarheidsspectroscopie bekeken. U zou nu de basis van de werking van UV-Vis moeten begrijpen, hoe een monster met een UV-Vis te meten en hoe de absorptie te correleren met de monsterconcentratie.
Dank voor het kijken!