Wat is een confocale microscoop?

Confocale microscopen hebben een superieure resolutie — veel hoger dan conventionele optische microscopen — en worden voornamelijk gebruikt in meettoepassingen. Confocale microscopen kunnen worden ingedeeld in reflectie- of transmissiemicroscopen op basis van het type verlichting dat voor de beeldvorming wordt gebruikt. De meeste confocale microscopen die in industriële toepassingen worden gebruikt, zijn van het reflectietype. Zij leveren een beeld met hoge resolutie waarbij alle gebieden in het gehele gezichtsveld scherp zijn, zelfs bij een monster met deuken en uitsteeksels op het oppervlak. Zij maken contactloze niet-destructieve metingen van driedimensionale vormen mogelijk.

Microscopen die een laser als lichtbron gebruiken, staan bekend als lasermicroscopen*1. Het zijn ook confocale microscopen. Aangezien zij een tweedimensionaal beeld vastleggen door punt- of lijnvormige lichtbundels in XY-richtingen te scannen, zijn zij ook een soort aftastmicroscopen zoals de aftastelektronenmicroscoop (SEM) en de aftastmicroscoop (SPM).

In het algemeen hangen de prestaties van een optische microscoop grotendeels af van de golflengte van het gebruikte licht en de numerieke apertuur (NA) van de objectieflens. Hoe klein de golflengte ook wordt, tenzij je de NA verhoogt, krijg je geen hogere resolutie. Om fijne patronen waar te nemen, hebt u een objectief met een hoge NA-waarde en een hoge vergrotingsfactor nodig. Als u echter een hoog NA-objectief met hoge vergrotingsfactor gebruikt voor het waarnemen van een hellend of ruw oppervlak, is het niet mogelijk om op elk punt in het gehele beeldveld scherp te stellen. Dit komt doordat, naarmate de NA groter wordt, de scherptediepte kleiner wordt. Er is een wisselwerking tussen resolutie en scherptediepte. Je kunt niet beide tegelijk krijgen.

Dit dilemma kan echter worden opgelost als je een confocale microscoop gebruikt. Hoe is dat mogelijk? Het antwoord ligt in de confocale optiek die op de microscoop wordt gebruikt.

Beeld met hoge resolutie

Confocale optiek biedt een unieke eigenschap die niet beschikbaar is in conventionele microscopen. Op een beeld dat met confocale optiek is gemaakt, worden gebieden waarop wordt gefocust gemarkeerd. Dit wordt optische doorsnede genoemd. Er is geen interferentie van ongewenst verstrooid licht van onscherpe gebieden op de gemarkeerde secties. U kunt dus een contrastrijk beeld met hoge resolutie krijgen. Als u een Z-scan*2 uitvoert en de hogeresolutiebeelden van alle gemarkeerde gedeelten aan elkaar plakt, kunt u een beeld maken met alle gebieden in focus. Met andere woorden, als u voortdurend de beelden van de gebieden met de hoogste helderheid vastlegt terwijl u de scherpstelposities wijzigt en ze in één beeld opneemt, krijgt u een beeld met scherpstelling op alle gebieden in het gehele gezichtsveld. Daardoor lijkt het alsof de scherptediepte dieper is gemaakt.

3D-beeld

Dankzij het effect van optische doorsnijding heeft confocale optiek een oplossend vermogen in Z-richting. Confocale optiek kan een driedimensionale structuur reproduceren met behulp van Z-positie gegevens op elk punt verkregen uit Z-scan. Dit betekent dat confocale microscopen verschillende metingen kunnen uitvoeren die niet mogelijk zijn met conventionele optische microscopen, zoals vormmeting, meting van hoogteverschillen en ruwheidsmeting.

*1Laser microscoop is ook bekend als laser scanning microscoop (LSM) of scanning laser microscoop (SLM).
*2Z scan is een scan die wordt uitgevoerd langs de optische as terwijl de afstand tussen het monster en de objectieflens wordt veranderd.