Western blot (WB) is een gangbare methode om eiwitten op te sporen en te analyseren. Het is gebaseerd op een techniek waarbij eiwitten die door elektroforese zijn gescheiden, worden overgebracht, ook wel blotting genoemd, van de gel naar een membraan waar ze specifiek kunnen worden gevisualiseerd. De procedure werd voor het eerst beschreven door H. Towbin e.a. in 1979 (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) en kreeg twee jaar later zijn naam door W. Neal Burnette (Burnette, 1981). Towbin et al beschreven de elektroforetische overdracht van eiwitten van polyacrylamide gels naar nitrocellulose vellen waarbij het oorspronkelijke gelpatroon nauwkeurig werd verkregen. De opstelling bestaat uit een standaardreeks van zeven stappen, Figuur 1.
Figuur 1. De standaardstappen bij Western Blotting.
De monsters worden geprepareerd en op een gel geladen en tijdens de elektroforese bewegen de negatief geladen eiwitten naar de positief geladen anode. Om de eiwitten verder te analyseren, worden ze overgebracht op een membraan in een procedure die blotting wordt genoemd. Na de overdracht wordt het membraan geblokkeerd om ongewenste membraan-eiwitinteractie in de volgende stappen te voorkomen. Om het betrokken eiwit te visualiseren wordt het membraan gewoonlijk eerst gesondeerd met een primair eiwitspecifiek antilichaam, gevolgd door een gelabeld secundair antilichaam dat voor detectie wordt gebruikt. Van het membraan wordt een afbeelding gemaakt en het resultaat wordt geanalyseerd.
Door een afzonderlijke markeroplossing toe te voegen aan een van de wells in de gel, is het mogelijk de grootte van het eiwit te schatten naast de antilichaaminteracties die worden gebruikt om het specifieke eiwit te verifiëren. De scheiding op de gel is niet alleen het gevolg van de grootte, maar ook in zekere mate van de moleculaire lading, de hydrofobe gebieden en de denaturatiegraad. De opzet van het experiment kan op vele manieren worden gevarieerd om zo goed mogelijk aan te sluiten bij het specifieke onderzoek. Bij de analyse van de resultaten moet rekening worden gehouden met de variaties tussen de banen wat betreft het laden en de overdrachtssnelheid tussen de blots. Bovendien is de niet-lineaire relatie van het gegenereerde signaal over het concentratiebereik van de monsters ook een aspect van overweging bij de interpretatie van de resultaten. Het resultaat van een WB-experiment hangt af van drie belangrijke factoren: het vermogen van het antilichaam om een specifiek eiwit te binden, de sterkte van de interactie, en de concentratie van het betrokken eiwit zelf. Bovendien zijn ook de specificiteit van de binding aan het doelwit en een lage kruisreactiviteit belangrijke kenmerken. Het resultaat van WB is niet altijd gemakkelijk te interpreteren, aangezien de grootte van het eiwit kan afwijken van het theoretische gewicht als gevolg van posttranslationele modificaties, zoals glycosylering, of interacties met andere eiwitten. WB is echter een veelgebruikte methode en bijna alle beschikbare commerciële antilichamen zijn met deze methode gevalideerd.
Technologie
Bemonstervoorbereiding
De eerste stap van een WB is de voorbereiding van het monster, bv. weefsel, cellen of een andere oplossing, dat zal worden geanalyseerd. Gewoonlijk moet het weefsel worden gebroken door mengen, homogeniseren of soniceren. Buffers worden toegevoegd om de cellen te lyseren en de eiwitten op te lossen en vaak wordt een inhibitor toegevoegd om denaturatie of degradatie te voorkomen. Verschillende soorten filtratie- en centrifugatiemethoden worden toegepast om de monsters verder voor te bereiden. Het is belangrijk de totale eiwitconcentratie van het verkregen extract te bepalen om een specifieke hoeveelheid op de gel te kunnen laden en zo een vergelijking tussen de monsters mogelijk te maken. Gewoonlijk wordt een biochemische test gebruikt om de eiwitconcentratie te bepalen. Het extract wordt dan verdund met een laadbuffer bestaande uit glycerol en een kleurstof (b.v. broomfenolblauw). De glycerol wordt gebruikt om het laden te vergemakkelijken door de dichtheid van het extract te verhogen en de kleurstof wordt toegevoegd om het monster zichtbaar te maken. De monsters worden verwarmd om de structuur van het eiwit te breken, waardoor de negatieve lading niet geneutraliseerd wordt (Mahmood & Yang, 2012). Bij voorkeur worden positieve en negatieve controles in de set-up opgenomen om de identiteit van het eiwit en de activiteit van het antilichaam te bevestigen.
Gelelektroforese
Na monstervoorbereiding is het extract klaar om te worden geladen om de eiwitten naar grootte te scheiden door gelelektroforese. Er wordt een elektrisch veld over de gel aangelegd dat de geladen moleculen in beweging brengt. In WB worden polyacrylamide-gels gebruikt voor eiwitscheiding en de methode wordt dan ook polyacrylamide gelelektroforese (PAGE) genoemd wanneer de natieve toestand wordt gebruikt. Voor denaturerende condities wordt natriumdodecylsulfaat (SDS) aan het systeem toegevoegd en de methode wordt daarom SDS-PAGE genoemd. De SDS bindt zich aan het eiwit en vormt een negatief geladen micelle rond het eiwit, ongeacht de inherente lading. De denaturerende toestand lost de driedimensionale structuur van de eiwitten op en de lading van het eiwit wordt relatief ten opzichte van zijn grootte, wat resulteert in scheiding van de eiwitten alleen op grootte. Bij gebruik van natieve omstandigheden is de mobiliteit afhankelijk van zowel de lading als de hydrodynamische grootte, waardoor veranderingen in de lading als gevolg van chemische degradatie, conformatieveranderingen door vouwen of ontvouwen, aggregatie of andere bindingsgebeurtenissen kunnen worden opgespoord.
De gel bestaat meestal uit twee delen met verschillende dichtheden: (i) een stapelingsgel, en (ii) een scheidingsgel, figuur 2. De verschillen tussen de twee secties zitten in de pH en de gelconcentratie. Bij een enigszins zure pH en een lagere acrylamideconcentratie worden de eiwitten in de stapelingsgel slecht gescheiden, maar kunnen zij wel sterk gedefinieerde scherpe banden vormen voordat zij in de scheidingsgel terechtkomen. Bij meer basische omstandigheden en een hogere gelconcentratie zorgt de scheidingsgel ervoor dat de eiwitten naar grootte verschillen, aangezien kleinere eiwitten sneller door de gel bewegen dan grotere. Voorgegoten gels zijn handig; het is echter ook mogelijk ze met de hand te gieten. De gel wordt ondergedompeld in buffer en de eiwitmonsters en markers worden in de putjes in de gel geladen. Er wordt een spanning op de gel gezet en de eiwitten zullen zich door hun negatieve elektrische lading over de gel beginnen te verplaatsen. De keuze van de juiste spanning is belangrijk omdat een te hoge spanning de gel oververhit en misschien de banden vervormt.
Figuur 2. Een typische gel ondergedompeld in buffer.
Blotten op membraan
Na gelelektroforese worden de eiwitten overgebracht op een stevig steunmembraan, de derde stap van Western Blot. Bij het transferproces wordt spanning toegepast om de eiwitten van de gel op het membraan over te brengen. De opstelling omvat sponzen, filtreerpapier, de gel en het membraan, dat tussen de gel en de positieve elektrode wordt geplaatst, figuur 3. Dit zorgt voor de migratie van de negatief geladen eiwitten van de gel naar het membraan. Er zijn drie soorten membranen: nitrocellulose, polyvinylideendifluoride (PVDF) en nylon. Hoewel nylonmembranen in verschillende opzichten superieur zijn, maken de hoge achtergrondbinding en de onomkeerbare kleuring van sommige kleurstoffen dit type membraan minder gangbaar dan de andere twee alternatieven. Het grote voordeel van nitrocellulosemembranen is de lage achtergrond, ongeacht de detectiemethode. Vanwege de relatief grote gemiddelde poriegrootte mogen nitrocellulosemembranen niet worden gebruikt voor de overdracht van eiwitten met een laag molecuulgewicht. Bovendien wordt het membraan, wanneer het droog is, bros, waardoor het moeilijk te hanteren is. Het stabielere PVDF-membraan maakt herlabeling mogelijk en is gemakkelijker te bewaren. De hydrofobe aard van PVDF resulteert in een hoge eiwitbindingscapaciteit, maar als gevolg daarvan is ook de achtergrond hoger.
Figuur 3. De eiwitten in de gel worden op een membraan gebloteerd en het monster wordt gevisualiseerd door blokkeren, toevoegen van antilichamen en wassen volgens een bepaald schema.
Er zijn twee methoden voor de blotting, nat en halfdroog. Natte omstandigheden verdienen de voorkeur wanneer de overdracht efficiënt moet zijn en een hoge kwaliteit moet opleveren wat betreft duidelijke en scherpe banden. Bovendien is dit de betere keuze voor de overdracht van grotere eiwitcomplexen. De gel, het membraan en het filterpapier worden tijdens de overdracht volledig ondergedompeld in buffer en er is geen risico dat de gel uitdroogt. Semi-droge blotting is sneller en er is minder volume buffer nodig. Deze overdrachtmethode is echter meestal minder efficiënt, vooral voor grotere eiwitten, en er is een risico van oververhitting en uitdroging van de gel bij gebruik van langere overdrachttijden.
Antilichaamprobeing
De vierde stap van de WB is antilichaamprobeing. Om te voorkomen dat de antilichamen aspecifiek aan het membraan binden, in plaats van specifiek aan het belanghebbende eiwit, wordt een stof gebruikt om de restplaatsen op het membraan te blokkeren. Veel gebruikte stoffen zijn gedroogde vetvrije melk, 5% Bovine Serum Albumine (BSA) verdund in Tris Buffered Saline Tween (TBST), normaal geitenserum, caseïne, of visgelatine (Mahmood & Yang, 2012). Melk is gemakkelijk te verkrijgen en goedkoop, maar niet geschikt voor alle detectielabels. Visgelatine geeft een lagere achtergrond maar kan sommige eiwitten maskeren en is ook een relatief dure blokkeerbuffer. BSA is goedkoop, terwijl serum immunoglobulinen kan bevatten die aanleiding geven tot kruisreactiviteit. Een zorgvuldige keuze van de blokkeervloeistof is essentieel, aangezien geen van de blokkeerbuffers ideaal is voor alle verschillende antigeen-antilichaaminteracties. De blokkeringsprocedure bestaat uit het incuberen van het membraan in de geschikte blokkeringsbuffer gedurende een uur of langer. Wanneer lange incubatietijden worden gebruikt, moet de blokkering worden uitgevoerd bij +4°C om het risico van kleuringartefacten of achtergrond uit te sluiten. Blokkeren is een delicaat evenwicht tussen het verminderen van de achtergrond zonder het signaal van het eiwit van belang te verminderen.
Het geblokkeerde membraan wordt vervolgens geïncubeerd met het primaire antilichaam. Het antilichaam wordt tot een geschikte concentratie verdund in TBST, fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) of wasbuffer. Het verdient de voorkeur het antilichaam met BSA te incuberen als het antilichaam opnieuw zal worden gebruikt. Na het wassen van het membraan wordt het membraan geïncubeerd met het secundaire antilichaam dat aan het primaire antilichaam bindt. Het secundaire antilichaam wordt gelabeld met een reporter. Wanneer een polyklonaal antilichaam als secundair antilichaam wordt gebruikt, kan dit aanleiding geven tot enige achtergrondkleuring. In het geval van achtergrondkleuring kan het secundaire antilichaam vooraf worden geblokkeerd met niet-immuun serum van de gastheer waarin het is aangemaakt. Optimalisatie van de concentratie van het secundaire antilichaam wordt aanbevolen wegens de vrij grote variaties tussen antilichamen en gebruikte detectiesystemen.
Detectie
In de vijfde stap van een WB wordt het eiwit-antilichaam-antilichaam complex op het membraan gedetecteerd. Er zijn verschillende soorten labeling van het secundaire antilichaam, bv. enzymen, fluoroforen, biotinylering, goudconjugering en radio-isotopen, zoals geïllustreerd in figuur 4. Onder de enzymen is HRP het meest gangbare enzym, dat samen met chemiluminescente, chemifluorescerende of chromogene stoffen wordt gebruikt. HRP heeft een hoge substraatspecificiteit met een lage achtergrond, is stabiel en niet duur. Bij chemiluminescentie katalyseert het HRP-enzym de oxidatie van luminol uit het luminolperoxidedetectiereagens. De reactie in meerdere stappen genereert lichtemissie. Bepaalde chemicaliën zoals fenolen kunnen het uitgezonden licht versterken. Een directe methode is het gebruik van fluorescentie; de fluoroforen zenden licht uit na te zijn geëxciteerd en er is geen detectiemiddel nodig. Deze methode is zeer geschikt voor kwantitatieve Westerns en aangezien verschillende fluoroforen licht van verschillende golflengten uitzenden, is het mogelijk multiplexing en specifieke detectie van meer dan één eiwit tegelijk toe te passen. Het gebruik van een chemische stof en/of een enzym om de vorming van een actieve fluorofoor uit een fluorogeen substraat te induceren wordt chemifluorescentie genoemd. Om de signaalintensiteit verder te verhogen kan een tweestapssysteem op basis van biotine en streptavidine worden gebruikt. Goudconjugatie is ook een methode waarbij eiwitten donkerrood kleuren door ophoping van goud. Het is ook mogelijk radio-isotopen te gebruiken, maar deze vereisen een speciale behandeling en zijn vrij duur.
Figuur 4. Verschillende reporter-systemen.
Imaging
Imaging is de zesde stap van WB en het vastleggen kan analoog gebeuren met behulp van een film, of digitaal vooraf met een CCD-camera of scanner die de verschillende soorten uitgezonden signalen vastlegt. Het CCD-beeldvormingsapparaat maakt kwantificering met hoge detectiegevoeligheid en een breed lineair bereik mogelijk zonder chemisch afval of de noodzaak van een donkere kamer. Het kan worden gebruikt voor de detectie van membranen, gekleurde gels, of voor toepassingen met ultraviolet licht.
Analyse
De laatste stap van een WB is het analyseren van de resultaten. In een typische kwalitatieve toepassing wordt de aanwezigheid van een interessant eiwit bevestigd, wordt de hoeveelheid bij benadering bepaald door visuele inspectie, en wordt de grootte bepaald door vergelijking met een marker. Verbeteringen en ontwikkelingen, met name in de richting van zeer gevoelige detectiereagentia en geavanceerde beeldvormingstechnieken, maken WB tot een potentieel instrument voor kwantitatieve analyse. De kwantitatieve toepassingen impliceren een definitie van de hoeveelheid eiwit in relatieve of absolute termen. Er moet rekening worden gehouden met een aantal factoren zoals gevoeligheid, signaalstabiliteit, lineair dynamisch bereik, normalisatie en signaal-ruisverhouding. Het minimum aan eiwit dat in een bepaalde test kan worden waargenomen geeft de aantoonbaarheidsgrens (LOD) aan, en de grens van de signaalintensiteit die betrouwbaar kan worden gebruikt voor een nauwkeurige kwantificering is de bepaalbaarheidsgrens (LOQ). Factoren die deze termen beïnvloeden zijn de kwaliteit en de concentraties van de antilichamen, alsmede de belichtingstijd wanneer de minimale hoeveelheid gedetecteerd eiwit in aanmerking wordt genomen. Een stabiel signaalsysteem vergroot het tijdsvenster voor het bereiken van een hoge gevoeligheid, meervoudige belichtingen, en de mogelijkheid om zwakke banden te detecteren. Het bereik dat een gelijkmatige en nauwkeurige kwantificering mogelijk maakt waarbij de signaalintensiteit nog steeds evenredig is met de hoeveelheid eiwit wordt het lineaire dynamische bereik genoemd. Het is belangrijk signaalverzadiging als gevolg van te grote hoeveelheden eiwit of hoge concentraties antilichamen te voorkomen. Een lage LOD en kwantificering van zowel zwakke als sterke signalen geeft een breed lineair dynamisch bereik. Het eiwit van belang moet worden genormaliseerd naar een interne referentie die fluctuaties in de hoeveelheid eiwit geladen op elke well of verschillende concentraties mogelijk maakt. Dit kan worden bereikt met housekeeping of spiked eiwit. De verhouding tussen signaal en ruis is belangrijk om het eiwit goed te kunnen kwantificeren. Dit is van het grootste belang bij de detectie van zwakke banden waar een hogere achtergrond wordt verwacht.
Specifieke voorbeelden
Hoewel het theoretische gewicht van veel eiwitten afwijkt van het werkelijke gewicht als gevolg van post translationele modificaties, worden bijna alle commerciële antilichamen gevalideerd met behulp van WB.
Binnen het Human Protein Atlas project wordt WB gebruikt voor kwaliteitscontrole van de polyklonale antilichamen die in het project worden gegenereerd. Na zuivering worden de antilichamen gebruikt om banden te detecteren in een opstelling van lysaat en verschillende weefsels. Het gebruik van siRNA WB wordt momenteel geïmplementeerd om de antilichamen verder te analyseren.
Het gehele WB-protocol, met inbegrip van de verdunning van zowel primaire als secundaire antilichamen en de laatste detectiestap, wordt routinematig uitgevoerd en er wordt geen specifieke experimentele optimalisatie uitgevoerd voor afzonderlijke antilichamen. Eerst worden totale eiwitlysaten van geselecteerde cellijnen en weefsels (15?g RT-4, U-251MG, lever, en tonsil, alsmede 25?g van HSA- en IgG-verarmd plasma) en een marker (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific) worden geladen op geprefabriceerde 4-20% Criterion SDS-PAGE gradiënt gels (Bio-Rad Laboratories) en uitgevoerd onder reducerende omstandigheden, gevolgd door overdracht naar PVDF membranen (Bio-Rad Laboratories) met Trans-Blot turbo (Bio-Rad Laboratories) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. De Criterion SDS-PAGE gradiënt gels maken het samen met de marker mogelijk eiwitten te analyseren in de maten variërend van 10 tot 250 kDa. De membranen worden vervolgens geactiveerd in methanol alvorens te worden geblokkeerd (5% droge melk, 0,5% Tween 20, 1× TBS; 1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur onder voortdurend schudden. De membranen worden vervolgens geïncubeerd met primair HPA-antilichaam, verdund tot ~ 0,6 g/ml, gedurende 1 uur, gevolgd door wassen (1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween) en incubatie gedurende 45 minuten met het secundaire peroxidase-geconjugeerde antilichaam (zwijnen anti-rabbit 1:4000, Dako). Voor commerciële antilichamen wordt een verdunning van 1:500 gebruikt en het secundaire antilichaam is ofwel varkens-antikrabbit (1:3000, Dako) of geiten-antimuis (1:3000, Dako). Een CCD-camera (Bio-Rad Laboratories) wordt gebruikt voor de detectie van het signaal van het substraat (Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate; Millipore).
Een typische Western Blot van HPA is te zien in figuur 5.
Figuur 5. Typisch Western Blot-resultaat met behulp van HRP en een CCD-camera.
Referenties en links
Het artikel waarin de methode wordt genoemd en meer in detail wordt beschreven:
Burnette WN., “Western blotting”: elektroforetische overdracht van eiwitten van natriumdodecylsulfaat–polyacrylamidegels op ongemodificeerde nitrocellulose en radiografische detectie met antilichaam en radiogeiodiseerd eiwit A. Anal Biochem. (1981)
PubMed: 6266278
Het artikel beschrijft de Western Blotting techniek, theorie, en het oplossen van problemen:
Mahmood T et al., Western blot: techniek, theorie, and trouble shooting. N Am J Med Sci. (2012)
PubMed: 23050259 DOI: 10.4103/1947-2714.100998
Het eerste artikel dat elektroforetische overdracht van eiwitten op membraan beschrijft:
Towbin H et al., Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. (1992)
PubMed: 1422008
Western Blotting Principles and Methods – een gratis handboek verstrekt door GE Healthcare:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooks
Western Blotting in het Human Atlas Protein project:
Western Blotting
Wikipedia – relevante links:
Polyacrylamide gelelektroforese
Western blot encyclopedie – Veel nuttige informatie over Western blot, evenals probleemoplossing, protocollen en antilichaamselecties:
http://www.western-blot.us
Antibodypedia – Een open-access database van publiek beschikbare antilichamen en hun bruikbaarheid in diverse toepassingen:
http://www.antibodypedia.com
VIDEO: Western blotting stap voor stap, een tutorial gemaakt door Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu