Jak działa technologia rekombinowanego DNA? Badany organizm, który zostanie wykorzystany do przekazania DNA do analizy, nazywany jest organizmem dawcy. Podstawowa procedura polega na wyodrębnieniu i pocięciu DNA z genomu dawcy na fragmenty zawierające od jednego do kilku genów i pozwoleniu tym fragmentom na indywidualne wstawienie się do otwartych małych, autonomicznie replikujących się cząsteczek DNA, takich jak plazmidy bakteryjne. Te małe koliste cząsteczki działają jako nośniki, lub wektory, dla fragmentów DNA. Cząsteczki wektora z ich wstawkami nazywane są rekombinowanym DNA, ponieważ składają się z nowych kombinacji DNA z genomu dawcy (który może pochodzić z dowolnego organizmu) z DNA wektora z zupełnie innego źródła (na ogół plazmidu bakteryjnego lub wirusa). Mieszanina rekombinowanego DNA jest następnie używana do transformacji komórek bakteryjnych i często zdarza się, że pojedyncze cząsteczki rekombinowanego wektora znajdują drogę do pojedynczych komórek bakteryjnych. Komórki bakteryjne są posiewane na płytki i pozwala się im rosnąć w kolonie. Pojedyncza transformowana komórka z pojedynczym wektorem rekombinantowym podzieli się na kolonię z milionami komórek, z których wszystkie będą nosicielami tego samego wektora rekombinantowego. Dlatego też indywidualna kolonia zawiera bardzo dużą populację identycznych wstawek DNA, a populacja ta nazywana jest klonem DNA. Znaczna część analizy sklonowanego fragmentu DNA może być przeprowadzona na etapie, gdy znajduje się on w organizmie bakteryjnym. Później jednak często pożądane jest ponowne wprowadzenie sklonowanego DNA do komórek pierwotnego organizmu dawcy w celu przeprowadzenia określonych manipulacji genomestruktury i funkcji. Stąd protokół często wygląda następująco:
MESJA
Klonowanie pozwala na amplifikację i odzyskanie określonego segmentu DNA z dużej, złożonej próbki DNA, takiej jak genom.
Ponieważ DNA dawcy zostało pocięte na wiele różnych fragmentów, większość kolonii będzie nosić inny rekombinowany DNA (to jest inną sklonowaną wstawkę). Dlatego następnym krokiem jest znalezienie sposobu na wyselekcjonowanie klonu z insertem zawierającym interesujący nas gen. Po uzyskaniu takiego klonu, DNA jest izolowane masowo, a sklonowany gen może być poddany różnym analizom, które omówimy w dalszej części rozdziału. Zauważmy, że metoda klonowania działa, ponieważ pojedyncze zrekombinowane cząsteczki DNA dostają się do poszczególnych komórek gospodarza bakteryjnego, a następnie komórki te wykonują pracę polegającą na amplifikacji pojedynczych cząsteczek do dużych populacji cząsteczek, które mogą być traktowane jako odczynniki chemiczne. Rysunek 12-1 przedstawia ogólny zarys tego podejścia.
Rysunek 12-1
Technologia rekombinowanego DNA umożliwia wstawianie pojedynczych fragmentów DNA z dowolnego genomu do wektorowych cząsteczek DNA, takich jak plazmidy, i ich indywidualną amplifikację w bakteriach. Każdy amplifikowany fragment nazywany jest klonem DNA.
Termin rekombinowane DNA należy odróżnić od naturalnych rekombinantów DNA, które powstają w wyniku krzyżowania pomiędzy chromosomami homologicznymi u botheukariotów i prokariotów. Rekombinowane DNA w znaczeniu używanym w tym rozdziale jest nienaturalnym połączeniem DNA pochodzącego z niehomologicznych źródeł, zwykle z różnych organizmów. Niektórzy genetycy preferują alternatywną nazwę chimeryczne DNA, od mitologicznego greckiego potwora Chimera. Przez wieki Chimera była symbolem niemożliwego połączenia biologicznego, połączenia części różnych zwierząt. Podobnie, rekombinowane DNA jest chimerą DNA i byłoby niemożliwe bez eksperymentalnych manipulacji, które nazywamy technologią rekombinowanego DNA.
Izolacja DNA
Pierwszym krokiem w tworzeniu rekombinowanego DNA jest izolacja DNA dawcy i wektora.Ogólne protokoły izolacji DNA były dostępne wiele dekad przed wynalezieniem technologii rekombinowanego DNA. Przy użyciu takich metod, większość DNA wyekstrahowanego z dawcy będzie jądrowym genomowym DNA u eukariotów lub głównym genomowym DNA u prokariotów; te typy są na ogół tymi, które są wymagane do analizy. Procedura wykorzystywana do uzyskania wektorowego DNA zależy od charakteru wektora. Plazmidy bakteryjne są powszechnie używanymi wektorami, a te plazmidy muszą być oczyszczone z bakteryjnego genomowego DNA. Protokół ekstrakcji plazmidowego DNA przez ultrawirowanie jest podsumowany na rysunku 12-2. Plazmidowe DNA tworzy wyraźne pasmo poultra-wirowaniu w gradiencie gęstości chlorku cezu zawierającym bromek etydyny. Pasmo plazmidowe jest zbierane przez przebicie otworu w plastikowej probówce wirówkowej. Inny protokół opiera się na obserwacji, że w określonym zasadowym pH genomowe DNA bakterii ulega denaturacji, ale plazmidy nie. Późniejsza neutralizacja powoduje wytrącenie genomowego DNA, ale plazmidy pozostają w roztworze. Fagi takie jak λ mogą być również wykorzystywane jako wektory do klonowania DNA w systemach bakteryjnych. Fagowe DNA jest izolowane z czystej zawiesiny fagów odzyskanych z lizatu afagów.
Ryc. 12-2
Plazmidy takie jak te niosące geny oporności na antybiotyk tetracyklinę (u góry po lewej) mogą być oddzielone od bakteryjnego chromosomalnego DNA. Ponieważ różne wiązania bromku etydyny przez te dwa gatunki DNA sprawiają, że kolisty plazmidDNA (więcej…)
Cięcie DNA
Przełomem, który umożliwił zastosowanie technologii rekombinacji DNA było odkrycie i scharakteryzowanie enzymów restrykcyjnych. Enzymy restrykcyjne są produkowane przez bakterie jako mechanizm obronny przed fagami. Enzymy te działają jak nożyczki, tnąc DNA faga i unieszkodliwiając go w ten sposób. Co ważne, enzymy restrykcyjne nie tną losowo, ale raczej tną specyficzne sekwencje docelowe DNA, co jest jedną z kluczowych cech, które czynią je odpowiednimi do manipulacji DNA. Każda cząsteczka DNA, od wirusowej do ludzkiej, zawiera miejsca docelowe enzymów restrykcyjnych czysto przypadkowo i dlatego może być pocięta na określone fragmenty o rozmiarze odpowiednim do klonowania. Miejsca restrykcyjne nie są istotne dla funkcji organizmu i nie zostałyby pocięte in vivo, ponieważ większość organizmów nie posiada enzymów restrykcyjnych.
Patrzmy na przykład: enzym restrykcyjny EcoRI (z E. coli) rozpoznaje następującą sekwencję sześciu par nukleotydów w DNA dowolnego organizmu:
Ten typ segmentu nazywany jest palindromem DNA, co oznacza, że obie nici mają tę samą sekwencję nukleotydów, ale w orientacji antyrównoległej.Wiele różnych enzymów restrykcyjnych rozpoznaje i przecina określone palindromy. Enzym EcoRI tnie w obrębie tej sekwencji, ale w parze przesuniętych w czasie cięć pomiędzy nukleotydami G i A.
To przesunięte w czasie cięcie pozostawia parę identycznych jednoniciowych „lepkich końców”. Końce te nazywane są lepkimi, ponieważ mogą wiązać wodorowo (przylegać) do komplementarnej sekwencji. Rysunek 12-3 przedstawia EcoRI wykonujący pojedyncze cięcie w kolistej cząsteczce DNA, takiej jak plazmid: cięcie to otwiera okrąg, a utworzona liniowa cząsteczka ma dwa lepkie końce. Wytwarzanie tych lepkich końców jest kolejną cechą enzymów restrykcyjnych, która czyni je odpowiednimi dla technologii rekombinacji DNA. Zasada jest po prostu taka, że jeśli dwie różne cząsteczki DNA są cięte tym samym enzymem restrykcyjnym, obie będą produkować fragmenty z takimi samymi komplementarnymi lepkimi końcami, co umożliwia tworzenie się chimer DNA. Stąd, jeśli zarówno wektorowe DNA, jak i DNA dawcy są cięte enzymem EcoRI, lepkie końce wektora mogą łączyć się z lepkimi końcami fragmentu dawcy, gdy te dwa fragmenty zostaną zmieszane.
Rycina 12-3
Egzzym restrykcyjny EcoRI tnie kolistą cząsteczkę DNA opatrzoną jedną docelową sekwencją, dając w wyniku liniową cząsteczkę z jednoniciowymi lepkimi końcami.
WIADOMOŚCI
Enzymy restrykcyjne mają dwie właściwości przydatne w technologii rekombinacji DNA.Po pierwsze, tną DNA na fragmenty o rozmiarze odpowiednim do klonowania. Po drugie, wiele enzymów restrykcyjnych wykonuje rozłożone w czasie cięcia, które tworzą jednoniciowe, lepkie końce sprzyjające tworzeniu rekombinowanego DNA.
Zidentyfikowano dziesiątki enzymów restrykcyjnych o różnej specyficzności sekwencji, niektóre z nich przedstawiono w Tabeli 12-1. Zauważysz, że wszystkie sekwencje docelowe są palindromami, ale, jak EcoRI, niektóre enzymy wykonują cięcia naprzemienne, podczas gdy inne wykonują cięcia płaskie. Nawet płaskie cięcia, które nie mają lepkich końców, mogą być użyte do tworzenia rekombinowanego DNA.
Tabela 12-1
Miejsca rozpoznawania, rozszczepiania i modyfikacji różnych enzymów restrykcyjnych.
DNA może być również cięte przez mechaniczne ścinanie. Na przykład, mieszanie DNA w mikserze spowoduje rozbicie długich cząsteczek wielkości chromosomu na odcinki dające się łączyć.
Łączenie DNA
Najczęściej, zarówno DNA dawcy jak i DNA wektora są trawione przy użyciu enzymu restrykcyjnego, który wytwarza lepkie końce, a następnie mieszane w probówce, aby umożliwić lepkim końcom DNA wektora i dawcy związanie się ze sobą i utworzenie cząsteczek rekombinacji. Rysunek 12-4 przedstawia wektor plazmidowy, który niesie pojedynczy restrykt EcoRI; tak więc trawienie enzymem restrykcyjnym EcoRI przekształca kolisty DNA w liniową cząsteczkę z lepkimi końcami. DNA dawcy z dowolnego innego źródła (powiedzmy, Drosophila) jest również traktowane enzymem EcoRI w celu wytworzenia populacji fragmentów posiadających te same lepkie końce. Kiedy te dwie populacje są zmieszane, fragmenty DNA z dwóch źródeł mogą się połączyć, ponieważ pomiędzy ich lepkimi końcami tworzą się podwójne heliksy. W roztworze znajduje się wiele otwartych cząsteczek wektora i wiele różnych fragmentów DNA dawcy, zawierających enzymEcoRI. Dlatego też powstanie zróżnicowany zestaw wektorów niosących różne inserty dawcy. Na tym etapie, chociaż lepkie końce połączyły się w celu wytworzenia populacji cząsteczek chimerycznych, szkielety cukrowo-fosforanowe nadal nie są kompletne w dwóch miejscach każdego połączenia. Jednakże, szkielety te mogą być uszczelnione przez dodanie enzymu ligazy DNA, która tworzy wiązania fosfodiestrowe w miejscach połączeń (Rysunek 12-4b). Niektóre ligazy są nawet zdolne do łączenia fragmentów DNA o tępo ściętych końcach.
Rysunek 12-4
Metoda generowania chimerycznego plazmidu DNA zawierającego geny pochodzące z obcego DNA. (Z S. N. Cohen, „The Manipulation of Genes. „Copyright © 1975 by Scientific American, Inc. All rightsreserved.)
Wzmacnianie rekombinowanego DNA
Zlinkowany rekombinowany DNA dostaje się do komórki bakteryjnej w wyniku transformacji. Po znalezieniu się w komórce gospodarza, wektor plazmidowy jest zdolny do replikacji, ponieważ plazmidy zwykle mają początek replikacji. Jednakże teraz, gdy donorowa wstawka DNA jest częścią długości wektora, donorowe DNA jest automatycznie replikowane razem z wektorem. Każdy zrekombinowany plazmid, który dostanie się do komórki, utworzy w niej wiele kopii samego siebie. Następnie, wiele cykli podziału komórkowego będzie miało miejsce, a zrekombinowane wektory przejdą więcej rund replikacji. Powstała w ten sposób kolonia bakterii będzie zawierała miliardy kopii jednoniciowej wstawki DNA. Ten zestaw amplifikowanych kopii pojedynczego fragmentu DNA dawcy to klon DNA (Rysunek 12-5).
Rysunek 12-5
Jak działa amplifikacja. Traktowanie DNA dawcy i wektora enzymami restrykcyjnymi umożliwia wstawianie pojedynczych fragmentów do wektorów. Pojedynczy wektor dostaje się do gospodarza bakteryjnego, gdzie w wyniku replikacji i podziału komórki powstaje duża liczba kopii fragmentu donora. (więcej…)