W tym wpisie omawiamy zjawisko dyfrakcji drugiego rzędu w monochromatorze i problemy, jakie może ona powodować w spektroskopii fluorescencyjnej.
Jest to drugi z serii wpisów na blogu (przeczytaj pierwszy wpis), w których omawiamy najczęściej popełniane błędy i artefakty eksperymentalne pojawiające się podczas pomiarów widm fluorescencji. Lista ta została pierwotnie zainspirowana przez „Rogue’s Gallery of Fluorescence Artefacts and Errors” w doskonałej książce „Introduction to Fluorescence” autorstwa Davida M. Jamesona.1 Te wpisy na blogu będą opierać się na tej liście, korzystając z doświadczeń naszych inżynierów operacyjnych i naukowców zajmujących się aplikacjami, którzy zaobserwowali najczęstsze błędy podczas odpowiadania na pytania klientów, odwiedzania laboratoriów i… czasami popełniania ich samemu.
Co to jest dyfrakcja drugiego rzędu?
W spektroskopii fluorescencyjnej monochromatory są używane do wyboru długości fali wzbudzenia i emisji. Typowy spektrometr fluorescencyjny składa się z dwóch monochromatorów; monochromatora wzbudzenia, aby wybrać pożądaną długość fali wzbudzenia i monochromatora emisji, aby wybrać, która długość fali dociera do detektora. Aby uzyskać więcej informacji na temat działania spektrometru fluorescencyjnego przeczytaj nasz artykuł „Wprowadzenie do pomiarów fluorescencji & Instrumentacja”.
Monochromatory wykorzystują siatki dyfrakcyjne w celu wyizolowania pożądanej długości fali z padającego światła szerokopasmowego. Szerokopasmowe światło pada na siatkę dyfrakcyjną, a różne długości fal, które składają się na światło, ulegają dyfrakcji pod różnymi kątami, tak aby spełnić równanie siatki,
gdzie m jest rzędem dyfrakcji, λ jest długością fali światła rozproszonego, d jest odstępem między rowkami kraty, jest kątem między światłem padającym a normalną kraty, θί jest kątem między światłem rozproszonym a normalną kraty. Można zauważyć, że dla stałych każda długość fali światła będzie rozpraszana pod innym kątem, co pozwala monochromatorowi wyizolować pożądaną długość fali. Można również zauważyć, że dla stałej i stałej λ równanie jest spełnione przy różnych kątach w zależności od rzędu dyfrakcyjnego m, który może przyjmować dodatnie i ujemne wartości całkowite (…-2, -1, 0, 1, 2…). Wartość ±1 jest określana jako dyfrakcja pierwszego rzędu i występuje najbliżej normalnej siatki, a jej intensywność jest największa. Podobnie wartość ±2 jest znana jako dyfrakcja drugiego rzędu i występuje pod płytszym kątem i jest słabsza w intensywności. Dyfrakcja przy wyższych rzędach przebiega według podobnego schematu zwiększania kąta od normalnej i zmniejszania intensywności.
W monochromatorze jest to tylko dyfrakcja pierwszego rzędu (albo +1 lub -1), która jest używana do wyboru pożądanej długości fali, a wyższe rzędy są niepożądane. Jednakże, ze względu na szeroki zakres długości fal ulegających dyfrakcji, zakresy kątów zajmowane przez dyfrakcję pierwszego i drugiego rzędu nie są unikalne. Jest to zilustrowane na rysunku 1, gdzie niebieski stożek reprezentuje zakres kątów, w których światło ulega dyfrakcji pierwszego rzędu, a czerwony stożek jest zakresem kątów, w których światło ulega dyfrakcji drugiego rzędu i istnieje obszar nakładania się, wspólny dla tych zakresów. Ten wspólny zakres można również zobaczyć z równania siatki. Rozważmy światło o długości fali 600 nm, które ulega dyfrakcji pierwszego rzędu (m = 1, λ = 600 nm) i światło o długości fali 300 nm, które ulega dyfrakcji drugiego rzędu (m = 2, λ = 300); jasne jest, że lewa strona równania siatki jest taka sama dla obu przypadków, a zatem kąt rozproszenia światła musi być równoważny. Konsekwencją tego jest to, że gdy monochromator jest ustawiony na przepuszczanie 600 nm, niewielka część światła o długości 300 nm będzie również przepuszczana, co może być problematyczne w spektroskopii fluorescencyjnej.
Występowanie dyfrakcji drugiego rzędu w widmach fluorescencji
Dyfrakcja drugiego rzędu jest szczególnym problemem dla próbek rozpraszających takich jak proszki, kryształy i zawiesiny koloidalne. Aby pokazać wpływ dyfrakcji drugiego rzędu na widma fluorescencji, przygotowano rozpraszającą próbkę fluorescencyjną poprzez zmieszanie roztworu barwnika fluorescencyjnego 2-aminopirydyny z Ludoxem, który jest koloidalną zawiesiną nanocząstek krzemionki i służy jako rozpraszacz. Roztwór wzbudzono przy 300 nm i zmierzono widmo emisji w zakresie od 250 nm do 950 nm, jak pokazano na rysunku 2, używając spektrometru fotoluminescencji FLS1000 z wyłączonym filtrem sortującym (patrz następna sekcja) monochromatora emisji. Pierwszy pik przy 300 nm odpowiada rozproszeniu Rayleigha światła wzbudzającego o długości 300 nm, które zostało rozproszone pierwszego rzędu w monochromatorze emisji. Następnie pojawia się fluorescencja pierwszego rzędu 1-aminopirydyny, która osiąga maksimum przy 380 nm. Piki te są następnie powtarzane jako artefakty drugiego rzędu z pikiem rozpraszania Rayleigha przy 600 nm i pikiem fluorescencji przy 760 nm. Słaby pik trzeciego rzędu rozproszenia Rayleigha może być również widoczny przy 900 nm. Mylenie artefaktów drugiego rzędu jako prawdziwej emisji fluorescencji jest częstym błędem wśród niedoświadczonych użytkowników fluorescencji i było nawet przyczyną błędnych raportów w literaturze. Jednym z przykładów jest publikacja pracy, która donosiła o nowych, słabych, długofalowych pasmach emisji tryptofanu i tyrozyny przy 675 nm i 600 nm, które były dodatkiem do dobrze znanej emisji UV tych reszt białkowych.3 Sześć miesięcy później Hutnik i wsp. opublikowali sprostowanie, które wykazało, że rzekoma długofalowa fluorescencja była po prostu dyfrakcją drugiego rzędu prawdziwej emisji UV tryptofanu i tyrozyny przy 340 nm i 300 nm.4
Removal of Second Order Diffraction Using Order Sorting Filters
Błędne pomylenie i opublikowanie artefaktu drugiego rzędu jest skrajnym przykładem, ale bardziej powszechnym problemem jest to, że rozproszenie drugiego rzędu często nakłada się na mierzoną emisję fluorescencji i zniekształca widmo. Rysunek 3a przedstawia widmo emisji tej samej próbki Ludox / 2-aminopirydid, która była użyta na rysunku 2, ale długość fali wzbudzenia została przesunięta do 240 nm, a zakres emisji zawężony. Rozproszenie drugiego rzędu jest teraz przy 480 nm i nakłada się na ogon fluorescencji 2-aminopirydyny, co uniemożliwia dokładny pomiar widma.Rozwiązaniem tego problemu jest zastosowanie filtrów sortujących porządek wewnątrz monochromatora. Filtry sortujące są filtrami długoprzepustowymi, które przepuszczają tylko fale o długości powyżej długości fali odcięcia filtra. Zasada działania filtrów porządkujących wewnątrz monochromatora jest przedstawiona na rysunku 4, gdzie filtry porządkujące są zamontowane w kole filtrowym znajdującym się przed szczeliną wyjściową. Gdy monochromator jest ustawiony na przepuszczanie 300 nm, siatka dyfrakcyjna jest obracana tak, że światło rozproszone o długości 300 nm jest kierowane na szczelinę wyjściową monochromatora, a koło filtrów jest obracane tak, że na drodze światła nie ma filtra długoprzepustowego i światło o długości 300 nm jest wysyłane z monochromatora zgodnie z życzeniem (lewy obraz). Gdy monochromator jest ustawiony na przepuszczanie światła 600 nm, siatka dyfrakcyjna jest obracana tak, że rozproszone światło 600 nm pierwszego rzędu jest kierowane na szczelinę wyjściową, czemu towarzyszy niewielka ilość światła 300 nm drugiego rzędu. Koło filtrów jest obracane tak, że przed szczeliną wyjściową znajduje się filtr długoprzepustowy 400 nm, który przepuszcza pożądane światło 600 nm, blokując jednocześnie niepożądane światło 300 nm (prawy obraz).
Korzyść z zastosowania filtrów porządkujących jest pokazana na Rysunku 3b, gdzie widmo zostało ponownie zmierzone z włączonym automatycznym kołem filtrów porządkujących w monochromatorze emisyjnym FLS1000. Filtr sortujący usuwa pik rozproszenia drugiego rzędu przy 480 nm i uzyskuje się prawdziwe widmo 2-aminopirydyny. Spektrometry FLS1000 i FS5 firmy Edinburgh Instruments są standardowo wyposażone w koła filtrów sortujących zarówno na monochromatorze wzbudzenia jak i emisji. Te koła filtrów są domyślnie włączone i są w pełni zautomatyzowane, a oprogramowanie Fluoracle® w FLS1000 i FS5 wybiera odpowiednie filtry do użycia na podstawie wyboru długości fali wzbudzenia i długości fali emisji. Te automatyczne koła filtrów pozwalają użytkownikowi na pomiar szerokich widm fluorescencji bez obawy, że artefakty drugiego rzędu zniekształcą jego pomiary.
Mamy nadzieję, że ten wpis na blogu pomógł w zrozumieniu obecności artefaktów drugiego rzędu w widmach fluorescencji i tego, jak można ich uniknąć, stosując filtry porządkujące.
- Introduction to Fluorescence, D. M. Jameson, CRC Press (2014)
- Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd, J. R. Lakowicz, Springer (2006)
- Macías, M. C. Pinto, C. Gutiérrez-Mérino, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan Solutions, Biochem Int. 15, 961-969 (1987)
- M. Hutnik, A. G. Szabo, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan: a Classic Example of Second Order Diffraction, Biochem Int. 16, 587-591 (1988)
Spectrometers for Preventing Second Order Diffraction
Spektrometry FS5 i FLS1000 wyznaczają standardy w spektroskopii fotoluminescencji w stanie ustalonym i w czasie zarówno dla badań podstawowych jak i rutynowych zastosowań laboratoryjnych. Aby uzyskać więcej informacji na temat FLS1000 i FS5, prosimy o kontakt z członkiem naszego zespołu pod adresem [email protected].
Bądź w kontakcie
Jeśli podobał Ci się ten wpis na blogu i chcesz być pierwszym, który zobaczy wszystkie najnowsze wiadomości, aplikacje i informacje o produktach, zapisz się do naszego rzadkiego biuletynu za pomocą czerwonego przycisku poniżej i śledź nas na mediach społecznościowych.
Więcej informacji na temat FLS1000 i FS5 znajdziesz na stronie [email protected].