Wyniki i dyskusja
Nasze podejście do oceny nukleacji helisy wykorzystuje surogat wiązania wodorowego (HBS) α-helisy, w których N-końcowe wiązanie wodorowe łańcucha głównego jest zastąpione wiązaniem kowalencyjnym (Fig. 1B) (20). We wcześniejszych doniesieniach opisaliśmy heliksy HBS, w których wiązanie wodorowe jest zastąpione wiązaniem węgiel-węgiel (21). Charakterystyka tych syntetycznych heliksów za pomocą spektroskopii CD i 2D-NMR, jak również analizy dyfrakcji rentgenowskiej pojedynczych kryształów, ujawnia, że wiernie naśladują one konformację kanonicznych α-heliksów (21, 22). Co ważne, heliksy HBS są zdolne do hamowania wewnątrzkomórkowych oddziaływań białko-białko, w których pośredniczą domeny α-helikalne, co potwierdza hipotezę, że związki te odtwarzają strukturę i funkcję α-helikali białkowych (23, 24). Aby przeanalizować wpływ różnych reszt na tworzenie helisy α, przygotowaliśmy analog HBS z wiązaniem disulfidowym, którego szybkość tworzenia można było monitorować w warunkach wodnych (25). Przypuszczaliśmy, że szybkość tworzenia się tego wiązania będzie stanowić unikalną sondę do badania parametrów biofizycznych związanych z tworzeniem helisy. Ponieważ wiązanie disulfid-HBS (dsHBS) naśladuje wewnątrzcząsteczkowe wiązanie wodorowe w α-helisach, wysunęliśmy hipotezę, że utlenianie bistiolu (bt) do disulfidu (ds) dostarczy bezpośredniej miary zarodkowania helisy (Rys. 1C). Szybkość tworzenia helisy dla modelowych peptydów została zmierzona za pomocą ultraszybkiej spektroskopii i mieści się w zakresie nanosekund (14, 26⇓⇓-29). Szybkości tworzenia disulfidów są znacznie wolniejsze (rzędu minut) w naszych warunkach reakcji (30). Dramatycznie wolniejsza skala czasowa dla tworzenia disulfidów sugeruje, że zależne od sekwencji różnice w szybkości tworzenia disulfidów odzwierciedlają populacje preequilibrium: reszty o wyższej skłonności do nukleacji sprzyjają tworzeniu disulfidów.
Połączone disulfidami heliksy HBS mogą pochodzić z utleniania macierzystych peptydów bistiolowych, umożliwiając łatwe podejście do kontrolowania konformacji peptydu (31⇓⇓-34). Oparliśmy nasz wstępny projekt peptydu na krótkim segmencie z domeny aktywacyjnej p53: XQEG*FSDLWKLLS (1), gdzie X i G* reprezentują reszty ograniczone dsHBS (35). Sekwencja p53 została wybrana, ponieważ ma stosunkowo niewiele kontaktów w łańcuchu bocznym, takich jak mostki jonowe, które mogą wpływać na wyniki. Wcześniej scharakteryzowaliśmy szereg analogów p53 HBS za pomocą spektroskopii CD i NMR, co pozwoliło nam przewidzieć potencjalne problemy z agregacją, które mogą wpływać na stabilizowane konstrukty (36⇓-38). Peptyd bistiolowy p53 jest słabo helikalny w buforach wodnych w temperaturze 295 K. Spektroskopia CD (Rys. 2A) pokazuje, że p53 dsHBS 1 jest wysoce helikalny w porównaniu z macierzystym peptydem bt (25). Wybraliśmy A, G, D, I, K, L, P i V jako reszty gościnne do tego badania. Wybór ten obejmuje reprezentatywne alifatyczne reszty o prostych łańcuchach i β-rozgałęzieniach wraz z dodatnio i ujemnie naładowanymi łańcuchami bocznymi.
Analiza konformacyjna i synteza nieograniczonych peptydów. (A) Spektroskopia CD sugeruje, że połączony disiarczkiem (ds) peptyd HBS jest wysoce helikalny w porównaniu do macierzystego bistiolu (bt). Badania CD przeprowadzono z 50 μM peptydów w 1 mM PBS. (B) Struktury ds-2A otrzymane metodą NMR. Widoki 20 struktur o najniższej energii pokazane są z atomami węgla, azotu i tlenu odpowiednio w kolorze szarym, niebieskim i czerwonym. Wiązanie disulfidowe jest pokazane żółtym kolorem. (C) Schemat reakcji utleniania. Konwersja bt-2Λ → ds-2Λ zachodziła w łagodnych warunkach utleniania; nieprzereagowany bistiol był gaszony maleimidem 3.
Po wstępnych eksperymentach peptyd 1 został zmodyfikowany przez zastąpienie natywnych reszt kwasu glutaminowego i fenyloalaniny odpowiednio lizyną i alaniną, aby uzyskać 2Λ: XΛKG*ASDLWKLLS. Nowa sekwencja została zaprojektowana w celu uniknięcia potencjalnych oddziaływań łańcuchów bocznych między resztami gościa (Λ) i odpowiadającą im pozycją i + 3; lizyna została włączona w celu zwiększenia rozpuszczalności gospodarza w wodzie. Druga pozycja została wybrana do wprowadzenia gości, ponieważ konformacja tej reszty jest zaangażowana w indukcję helisy w pobliżu terminalu N (39, 40). Konformację helikalną ds-2A: XAKG*ASDLWKLLS oceniano stosując kombinację badań 1D NMR, spektroskopii korelacji całkowitej i spektroskopii korelacji rotacyjno-ramowej z efektem Overhausera (ROESY) w roztworach wodnych (SI Text, Tabela S1 i Rys. S1). Widma ROESY ujawniły krzyżowe piki jądrowego efektu Overhausera (NOE) wskazujące na strukturę helikalną, w tym sekwencyjne NH-NH (i oraz i + 1) oraz kilka NOE o większym zasięgu (pomiędzy i oraz i + 3/i + 4) (SI Text, Table S2). Co ważne, wszystkie kąty dihedralne ϕ szkieletu, obliczone na podstawie stałych sprzężenia 3JNHCHα, znajdują się w oczekiwanym zakresie dla konformacji helikalnych (SI Text, Table S1) (41, 42). Stałe sprzężenia obserwowane dla reszt w obrębie makrocyklu nie różnią się od reszty łańcucha, co wskazuje, że ograniczenie disulfidowe wiernie indukuje konformację α-helikalną. Struktura roztworu ds-2A została wyznaczona na podstawie 48 szczytów krzyżowych ROESY i 11 obliczonych kątów ϕ przy użyciu przeszukiwania konformacyjnego Monte Carlo w programie Macromodel 2014. Nakładka 20 najniżej energetycznych struktur dla ds-2A jest przedstawiona na Rys. 2B. Warto zauważyć, że makrocykl ograniczony disiarczkami nie zaburza N-końca helisy α. Ogólnie, wraz ze spektroskopią CD, badania NMR potwierdzają stabilizację głównej konformacji α-helisy w peptydach ograniczonych dsHBS.
Peptydy bistiolowe i HBS zostały zsyntetyzowane w sposób przedstawiony w SI Text, Rys. S2. Do utleniania bistioli zastosowaliśmy łagodne warunki utleniania składające się z 2% (vol/vol) DMSO (Rys. 2C) (25, 30). Aby rozdzielić blisko spokrewnione peptydy bistiolowe i dsHBS na HPLC i wygasić grupy tiolowe, potraktowaliśmy mieszaninę reakcyjną pochodną maleimidu (43). Odpowiednie rozdzielenie peptydów bistiolowych i disulfidowych na HPLC pozwoliło nam na ilościowe określenie szybkości tworzenia się disulfidów dla każdej sekwencji na podstawie analizy powierzchni pików HPLC (Fig. 3A i Fig. S3). Początkowe szybkości tworzenia disulfidów są wykreślone na Rys. 3B, a dane tabelaryczne przedstawiono w Tabeli 1.
Analiza konwersji bistiolu do disulfidu. (A) Szybkości konwersji bt-to-ds analizowano metodą HPLC, z tryptofanem jako kontrolą wewnętrzną. Przedstawiono reprezentatywne wyniki HPLC dla peptydu 2 z alaniną (Λ = A) jako resztą gościnną. (B) Wykresy konwersji bt-to-ds dla różnych reszt gościnnych. (C) Widma CD sekwencji z różnymi resztami gościa ilustrują, że zawartość helikalna większości sekwencji, z wyjątkiem sekwencji z Λ = G, P i D, jest identyczna. Badania CD przeprowadzono z 50 μM peptydów w 5 mM KF, pH 7,3.
- View inline
- View popup
Porównanie szybkości tworzenia dsHBS do literaturowych wartości propensity helisy
Odkryliśmy, że propensity nukleacji alaniny jest silniejszy niż glicyny, podczas gdy tworzenie wiązania disiarczkowego z proliną jako gościem jest zbyt wolne, aby dokładnie zmierzyć. Wyniki te s± zgodne ze znanymi zależno¶ciami: glicyna jest reszt± wysoce elastyczn±, podczas gdy prolina wspomaga helikoidalno¶ć tylko jako reszta N-kapsułkowa, a nie w innych pozycjach w helisie. Wyniki te wskazują również, że konformacja makrocyklu wpływa na szybkość tworzenia disulfidów. Gdyby tempo powstawania wiązania było niezależne od konformacji makrocyklu, podstawienie pojedynczej glicyny w miejsce alaniny nie spowodowałoby znaczącego efektu. Jest prawdopodobne, że łańcuch peptydowy poza domniemanym makrocyklem wpływa na konformację preequilibrium, ale ponieważ peptyd bistiolowy jest w dużej mierze nieα-helikalny, spodziewamy się, że ten efekt będzie subtelny i równoważny dla każdego mutanta.
Sekwencje leucynowe i alaninowe są podobne pod względem szybkości tworzenia disulfidów, jak można się spodziewać na podstawie wartości propensity z literatury (Tabela 1) (6). Wyniki te dostarczają użytecznych metryk do oceny potencjału naszego modelu syntetycznego jako sondy nukleacji helisy. Zaskakująco, nasze badania ujawniają, że reszty rozgałęzione β nie są szkodliwe dla zarodkowania helisy α. Istotnie, szybkość tworzenia disulfidu z waliną jest prawie taka sama jak z alaniną i leucyną, podczas gdy izoleucyna prowadzi do niewielkiego spadku. Reszty naładowane, lizyna i asparaginian, spowalniają szybkość reakcji do poziomu glicyny. Ponieważ kwas asparaginowy jest znanym łamaczem helisy, podczas gdy lizyna uważana jest za resztę stabilizującą helisę (44, 45), wyniki te sugerują, że reszty naładowane potencjalnie uczestniczą w oddziaływaniach dalekiego zasięgu. Chociaż sekwencje w tym badaniu zostały zaprojektowane tak, aby zminimalizować zależność od kontekstu, nie można całkowicie wykluczyć oddziaływań szkieletowych. Spektroskopia CD pokazuje, że pięć z ośmiu sekwencji dsHBS ma bardzo podobną zawartość helikali; substytucja glicyny, proliny i kwasu asparaginowego obniża helikalność (Rys. 3C). Przypuszczamy, że stabilno¶ć helikalna ograniczonej sekwencji nie jest głównym czynnikiem determinuj±cym powstawanie stopu disiarczkowego. Porównanie sekwencji lizyny i kwasu asparaginowego dostarcza wsparcia dla tej hipotezy, ponieważ sekwencje te wykazują podobne tempo tworzenia się disiarczków, podczas gdy ograniczone peptydy wykazują różną stabilność helikalną. Naładowane reszty na końcu heliksu mogą pozytywnie lub negatywnie wpływać na stabilność helisy w oparciu o ich oddziaływania z makrodipolem helisy (46). Jednak takie oddziaływania makrodipolarne nie powinny wpływać na proces nukleacji helisy, ponieważ helisa nie jest jeszcze zorganizowana.
Aby uzyskać teoretyczne wsparcie dla naszych obserwacji eksperymentalnych, obliczyliśmy bariery aktywacji do tworzenia wiązania wodorowego i do i + 4 w sekwencjach peptydowych za pomocą symulacji metadynamicznych (47, 48). Przejścia helisa-cewka były wcześniej badane przy użyciu symulacji molekularno-dynamicznych w celu analizy skłonności do tworzenia helis i czasów zarodkowania, ale według naszej wiedzy wpływ mutacji punktowych na zarodkowanie helisy nie był systematycznie badany (28, 39, 49). Określiliśmy wpływ różnych reszt na powstawanie α-skrętu w acetylowanej i metyloamidowanej modelowej sekwencji peptydowej, Ac-AΛA-NHMe. Wykorzystaliśmy rozkład Schrodingera 2012 Desmond 3.1 (50) do przeprowadzenia 50-ns symulacji metadynamicznych na tripeptydzie przy użyciu pola siłowego Amber ff12SB i związanych z nim parametrów jonów monowalentnych (51, 52). Wyznaczono dwuwymiarowe powierzchnie energii swobodnej i zidentyfikowano energie aktywacji poprzez inspekcję (Rys. 4). Energie aktywacji stabilizują się wraz ze wzrostem długości symulacji, co sugeruje, że symulacja osiągnęła zbieżność przy 15 ns (Rys. S4). Przeprowadziliśmy również symulacje w trzech powtórzeniach i zmierzyliśmy średnią wartość skuteczną pomiędzy wynikowymi powierzchniami energii swobodnych (Rys. S4). Analiza ujawnia, że wszystkie reszty gościnne (Λ), z wyjątkiem proliny, próbkują kąty dwuścienne odpowiadające lewoskrętnym i prawoskrętnym regionom α-helisy, β-strandu i poliproliny II (PPII) na wykresie Ramachandrana (Rys. 4A). Wykres dla tripeptydu zawierającego prolinę charakteryzuje się jedynie minimami α i PPII (Rys. 4B). Wykresy dla pozostałych 18 reszt gościnnych w Ac-AΛA-NHMe są przedstawione na Rys. S5. Ważona frakcja populacji α, β i PPII dla różnych reszt gościnnych jest wykreślona na Rys. 4C. Aby obliczyć barierę dla tworzenia helisy, porównaliśmy wysokość najkrótszego piku pomiędzy najniższą energią basenu odpowiadającego kątom dihedrycznym PPII lub β do dihedrynu α-helikalnego dla każdej reszty (Rys. 4D). Kąty dihedralne PPII okazały się być konformacją o najniższej energii dla większości reszt gościnnych w naszych obliczeniach.
Wyniki symulacji metadynamicznej do oceny bariery dla utworzenia wiązania wodorowego i do i + 4 w modelowym peptydzie (AcAΛA-NHMe) w funkcji różnych reszt gościnnych. (A i B) Pokazano dwuwymiarowe powierzchnie swobodnej energii dla Λ = alanina i prolina, pozostałe są zawarte w SI Text. Działki Ramachandrana dla wszystkich reszt pokazują niskoenergetyczne baseny dla przestrzeni dihedralnych α, β i poliproliny II (PPII) z wyjątkiem proliny, gdzie dominują przestrzenie PPII i α. (C) Ważone populacje wszystkich niskoenergetycznych zagłębień odpowiadających kątom dedrycznym α, β i PPII. (D) Bariera energii aktywacji pomiędzy najniżej energetycznym regionem odpowiadającym przestrzeni PPII i α-helical dihedral angles.
Wyniki tych obliczeń korelują z danymi eksperymentalnymi i sugerują, że bariera preorganizacji konformacji α-helical nie podąża za skalami propensity. Chociaż energie aktywacji odzwierciedlają populacje wyjściowe i profile energetyczne konformacji α i β lub PPII, dostarczają one miernika do oszacowania zależnej od reszty trudności przyjęcia konformacji α-helikalnej. Obliczone wartości ∆G‡ identyfikują reszty gościnne o szybkim i wolnym tempie fałdowania, ale sugerują, że tempa kilku innych nie są łatwe do rozróżnienia. Ogólnie rzecz biorąc, obliczenia potwierdzają obserwacje eksperymentalne, że skale skłonności do tworzenia helis nie mają zastosowania do zarodkowania helis.