Kwas mlekowy produkowany jest w postaci kwasu mlekowego L (+) lub D (-) lub jako jego mieszanina racemiczna. Organizmy, które wytwarzają formę L (+) lub D (-) posiadają dwie dehydrogenazy mleczanowe (LDH), które różnią się stereotypowością. Niektóre Lactobacillus wytwarzają formę L (+), która po nagromadzeniu indukuje racemazę, która przekształca ją w D (-) kwas mlekowy aż do uzyskania równowagi.
Dehydrogenaza mleczanowa L u L. casei jest enzymem allosterycznym z fruktozo-1,6-bisfosforanem (FDP). W niektórych przypadkach Mn2+ pełni rolę kofaktora. LDH u L. casei i eukariotów oraz u L. casei i kręgowców wykazuje podobieństwo odpowiednio 37% i 76%, ale miejsca aktywne wykazują podobieństwo odpowiednio 70% i 86%, co świadczy o tym, że zasadnicze części tego enzymu zostały zachowane. W porównaniu z enzymami kręgowców, u L. casei stwierdzono brak 12-aminokwasowych reszt na N-końcu, co jest wspólną cechą enzymów bakteryjnych, niezależnie od zachowania allosterycznego. L. casei posiada również 7 dodatkowych reszt aminokwasowych na końcu C, ale nie wiadomo, czy jest to również charakterystyczne dla enzymów bakteryjnych, ponieważ nie są dostępne kompletne sekwencje innych enzymów bakteryjnych.
Pomimo różnic w strukturze pierwotnej, analiza krystalograficzna wykazuje, że ogólna struktura enzymów allosterycznych L. casei i enzymów nieallosterycznych u kręgowców jest podobna. Dlatego prawdopodobnie niewielkie zmiany w strukturze pierwotnej są odpowiedzialne za jego zachowanie allosteryczne. Brak pierwszych 12 aminokwasów na N-końcu wskazuje na możliwe miejsce wi±zania efektora, co również tłumaczy hamuj±cy efekt dysocjacji Mn2+ lub (Mn2+ + FDP) na enzym. Enzym tetrameryczny dysocjuje do dimerów, wykazując dostępność wolnego rozpuszczalnika dla reszt tyrozynowych, które mogą nie być zlokalizowane w regionie kontaktowym podjednostki. Reszty tryptofanowe wykazują absorpcję UV i fluorescencję białkową pod wpływem wiązania efektora, ale stwierdzono, że fluorescencja białkowa ulega zniszczeniu w bromku dimetylosulfoniowym, a także nie ma wpływu na wiązanie FDP. Może to być zatem związane z jakąś odległą resztą tyrozynową. Stwierdzono natomiast, że szlaki metaboliczne L. casei są kontrolowane przez rodzaj dostępnych węglowodanów, które determinują ilość FDP i intermediatów fosforanu triozy. Te z kolei kontrolują aktywność LDH i innych enzymów do produkcji metabolitów innych niż kwas mlekowy. U L. bulgaricus odnotowano również niezależną od FDP kontrolę dehydrogenazy mleczanowej. Kiedy organizm ten był hodowany w hodowli ciągłej, zmiana pH z kwaśnego na zasadowe powodowała katabolizację cukru w trybie heterofermentacji przez szlak rozszczepienia fosfoketolazy. Sugeruje to, że dehydrogenazy mleczanowe w bakteriach kwasu mlekowego były pod kontrolą nie tylko allosterycznych wpływów, ale także ekspresji genów.
Genetycznie modyfikowane bakterie kwasu mlekowego dla poprawy L (+) bakterii kwasu mlekowego
Podjęto kilka prób poprawy produkcji L (+) kwasu mlekowego poprzez inżynierię metaboliczną w bakteriach kwasu mlekowego produkujących zarówno L (+) jak i D (-) kwas mlekowy.
W Lactobacillus helveticus inaktywacja genu ldhD (gen dehydrogenazy D-mleczanowej) prowadziła do dwukrotnego zwiększenia ilości L (+) kwasu mlekowego, przywracając tym samym całkowitą ilość kwasu mlekowego do poziomu występującego w szczepie typu dzikiego. Metodą substytucji genów skonstruowano dwa stabilne szczepy Lactobacillus helveticus ldhD minus. Jeden szczep został skonstruowany poprzez wewnętrzną delecję regionu promotora, co uniemożliwiło transkrypcję genu ldhD. Drugi konstrukt został przygotowany poprzez zastąpienie genu ldhD genem ldhL, duplikując w ten sposób dawkę genu.
Aktywność dehydrogenazy mleczanowej L była zwiększona odpowiednio o 53% i 93% w dwóch zmodyfikowanych szczepach w porównaniu do szczepu typu dzikiego. Dwa szczepy negatywne wobec dehydrogenazy D-mleczanowej produkowały tylko L (+) mleczan w ilości równej całkowitej ilości mleczanu produkowanego przez szczep typu dzikiego (Nikkila et al. 2000).
Gen kodujący dehydrogenazę L (+) mleczanową został wyizolowany z Lactobacillus plantarum i sklonowany do Escherichia coli. Gen ten został zsekwencjonowany i użyty do skonstruowania szczepów Lactobacillus plantarum z nadekspresją lub bez ekspresji ldhL. Wielokopijny plazmid zawierający gen ldhL został wprowadzony do Lactobacillus plantarum bez modyfikacji sygnałów ekspresji. Spowodowało to 13-krotne zwiększenie aktywności dehydrogenazy L-mleczanowej, ale nie miało prawie żadnego wpływu na produkcję L (+) mleczanu lub D (-) mleczanu. Stabilna chromosomalna delecja w genie ldhL spowodowała brak aktywności dehydrogenazy L-mleczanowej i wyłączną produkcję D-izomeru mleczanu (Ferain et al. 1994).
W Lactococcus lactis, gdy zwiększono liczbę kopii operonu lac, w którym znajduje się gen ldhL, spowodowało to niewielki wzrost produkcji kwasu mlekowego (Davidson et al. 1995).
Wyizolowano gen dehydrogenazy D-mleczanowej (ldhD) Lactobacillus johnsonii, a do inaktywacji genomowej kopii dzikiego szczepu wykorzystano in vitro skróconą kopię tego genu. W tym celu wygenerowano 8-bp delecję w obrębie sklonowanego genu ldhD, aby unieszkodliwić jego funkcję. Plazmid zawierający zmienioną ldhD został przeniesiony do Lactobacillus johnsonii poprzez koniugacyjną komobilizację z Lactococcus lactis. Wyselekcjonowano krzyżowe integracje plazmidu w genomowym miejscu ldhD, a w wyniku odpowiedniej rozdzielczości struktur otrzymano mutanty całkowicie pozbawione aktywności dehydrogenazy mleczanowej D. Niższa pozostała aktywność dehydrogenazy L-mleczanowej przekierowywała pirogronian do L-mleczanu z marginalnym wzrostem wtórnych produktów końcowych: acetaldehydu, acetoiny i diacetylu (Lapierre et al. 1999).
E. coli jest fakultatywnym beztlenowcem, który prowadzi fermentację mieszaną aktywność dehydrogenazy glukozy, nie była również w stanie rosnąć na glukozie. Jednakże, mutant podwójny dehydrogenazy alkoholowej (adh), fosfotransacetylazy (pta) był w stanie rosnąć beztlenowo na glukozie poprzez fermentację mleczanową produkując D-mleczan i niewielką ilość bursztynianu. Dodatkowa mutacja w genie karboksylazy fosfoenolopirogronianowej sprawiła, że mutant produkował D-mleczan jak homofermentatywny, w którym głównymi produktami są mrówczan, octan, d-mleczan, bursztynian i etanol. Mutant pta-, który nie jest zdolny do syntezy fosfotransacetylazy odpowiedzialnej za tworzenie octanu, nie był w stanie rosnąć na glukozie. Mutant adh nie posiada alkoholu u bakterii kwasu mlekowego (Narayanan i wsp. 2004). Gen dehydrogenazy L-mleczanowej został wprowadzony do mutanta pozbawionego genu dehydrogenazy D-mleczanowej, co spowodowało wytwarzanie dehydrogenazy L-mleczanowej jako głównego produktu fermentacji (Chang et al. 1999).
Rhizopus oryzae posiada enzymy fermentacji etanolowej, które pozwalają grzybowi rosnąć przez krótkie okresy w nieobecności tlenu. Wyizolowano mutanta, który wyrażał tylko 5% aktywności dehydrogenazy alkoholowej typu dzikiego w warunkach ograniczających dostęp tlenu. W ten sposób pirogronian był kierowany do tworzenia kwasu mlekowego (Skory et al. 1998).
Surowce
Na przestrzeni lat autorzy przebadali wiele węglowodanów i materiałów azotowych do produkcji kwasu mlekowego. Były one badane pod kątem wysokiej wydajności kwasu mlekowego, optymalnej produkcji biomasy, nieistotnego powstawania produktów ubocznych, szybkiego tempa fermentacji, mniejszej ilości obróbki wstępnej, łatwego przetwarzania w dół strumienia, niskich kosztów, łatwej dostępności itp. Wybór surowca do wykorzystania zależy od badanych mikroorganizmów, a także od pożądanego produktu.
Sukroza (z syropów, soków i melasy), laktoza (z serwatki), maltoza (wytwarzana w specyficznych procesach enzymatycznej konwersji skrobi), glukoza (z procesów konwersji skrobi, mannitol itp.) były wykorzystywane komercyjnie. Melasa jest tania, ale daje niską wydajność kwasu mlekowego i wymaga pracochłonnych procedur oczyszczania. Serwatka jest również tania i łatwo dostępna, ale podobnie jak melasa ma kosztowne procesy oczyszczania. Stymuluje to rozwój nowoczesnych technologii, takich jak ultrafiltracja i elektrodializa (Kulozik i Wilde, 1999). Zbadano również hydrolizowaną skrobię ziemniaczaną, kukurydzę, słomę, serwatkę, łuski nasion bawełny, grejpfruta, odpadowy ług siarczynowy itp. Przeprowadzono również badania nad produkcją kwasu mlekowego L (+) przez R. oryzae przy użyciu skrobi kukurydzianej i kolb kukurydzy w bioreaktorze z podnoszeniem powietrzem i bioreaktorze ze złożem włóknistym.
Prowadzone są również badania mające na celu opracowanie procesów mikrobiologicznych do produkcji wysokiej czystości kwasu mlekowego przy niskich kosztach ze skrobi sago, która występuje w dużych ilościach w Sarawak, Malezji, Riau i Indonezji. Kwas mlekowy jest również produkowany poprzez jednoczesne sacharyfikację i fermentację wstępnie przetworzonych włókien alfa.
Badano wiele materiałów azotowych, takich jak permeat serwatki, ekstrakt drożdżowy, kiełki słodowe, orzechy do czesania słodu, ekstrakt z trawy, peptony, ekstrakt wołowy, hydrolizat kazeiny, ług stromy kukurydziany, N-Z-amina, hydrolizat sojowy z dodatkiem witamin w celu uzupełnienia źródeł węglowodanów, aby dać szybki i ciężki wzrost. Jednakże ekstrakt drożdżowy wydaje się być najbardziej efektywnym suplementem. Testowano jedenaście różnych źródeł azotu. Badano różne ilości witamin z grupy B w celu zastąpienia ekstraktu drożdżowego (Hujanen i Linko, 1996). Są one utrzymywane na minimalnym poziomie, aby ułatwić proces regeneracji. Dodatkowe minerały są czasami wymagane, gdy źródła węglowodanów i azotu nie występują w wystarczających ilościach.
Procesy fermentacyjne
Fermentacja kwasu mlekowego jest znana jako fermentacja hamowana przez produkt końcowy w postaci niezdysocjowanej formy kwasu mlekowego. Przeprowadzono szereg badań w celu przezwyciężenia tego problemu. Stwierdzono, że zastosowanie techniki ekstrakcyjnej fermentacji kwasu mlekowego może dać wydajność kwasu mlekowego 0,99g/l i produktywność kwasu mlekowego 1,67 g/l/h w porównaniu z konwencjonalnym reaktorem okresowym, który dał wydajność 0,83 g/l i produktywność kwasu mlekowego 0,31 g/l/h (Srivastava et al. 1992). Do separacji mleczanu zastosowano żywicę jonowymienną amberlite IRA-400. Ponieważ niższa temperatura sprzyja adsorpcji, a wyższa produkcji kwasu mlekowego, za optymalną do produkcji kwasu mlekowego metodą ekstrakcyjnej fermentacji mlekowej uznano temperaturę 39ºC. Metoda wymiany anionowej została zastosowana do odzyskiwania kwasu mlekowego z roztworu kwasu mlekowego i glukozy w systemie fermentacji ekstrakcyjnej opartej na membranie jonowymiennej (Ziha i Kefung, 1995). Roychoudhury i wsp. 1995 opisali różne procesy ekstrakcyjnej fermentacji kwasu mlekowego.
Wykazano, że jon wodorowy miał negatywny wpływ na metabolizm komórek Lactococcus lactis podczas bioprocesu elektrodializy, w którym filtrat hodowlany krążył przez przedział katodowy (Nomura i wsp. 1998). Badali oni stymulację tempa fermentacji L-mleczanowej przez okresową elektrodializę. Badano bioproces elektrodializy, w którym mleczan i octan są usuwane jednocześnie, co pozwala na utrzymanie niskiego poziomu mleczanu w bulionie, co zmniejsza inhibicję produktu końcowego. Jony wodorowe mają hamujący wpływ na metabolizm komórek, dlatego zastosowanie standardowego elektrodializatora umożliwia cyrkulację filtratu hodowlanego przez komorę dializacyjną, tak aby hodowla nie stykała się z katodą. Umożliwiło to całkowite zużycie ksylozy w krótszym czasie.
Głównie dwa systemy reaktorów pozwalają uzyskać wysoką wydajność i produktywność kwasu mlekowego: – ciągły proces fermentacji z recyrkulacją komórek (Rysunek 1) i fermentacja wsadowa z podawaniem (Rysunek 2). Odnotowano wysoką wydajność objętościową wynoszącą 117 g/l/h przy użyciu bioreaktora membranowego z recyrkulacją komórek, ale nie skutkuje to wysokim stężeniem produktu, a proces przebiega w sposób ciągły z ciągłym odpowietrzaniem komórek, aby zapobiec zmianie płynności, która występuje, gdy stężenie komórek jest zbyt wysokie. Aby przezwyciężyć ten problem, zastosowano CSTR w układzie szeregowym (Kulozik et al. 1992). Zwiększyło to wydajność i stężenie kwasu mlekowego. Wysoka czystość izomeru L (+) kwasu mlekowego wzrosła również dzięki zwiększonej populacji świeżych komórek. Zbadano wydajność siedmiostopniowego reaktora kaskadowego z recyrkulacją komórek. Badano szeregowe bioreaktory z recyklingiem komórek (MCRB), w których uzyskano wysoką gęstość komórek z wysoką wydajnością kwasu mlekowego wynoszącą 5,7 g/l/h i stężeniem kwasu mlekowego 92 g/l (Kwon et al. 2001). Zbadano ciągłą produkcję mleczanu amonu w reaktorze 3-stopniowym (Borgardts et al. 1998). Różne badane czasy retencji wykazały wyższą wydajność mleczanu i wyższe wykorzystanie laktozy. Stwierdzono, że fermentacja ciągła z wykorzystaniem permeatów serwatki charakteryzuje się wysoką produktywnością. Przeprowadzono eksperymenty z recyklingiem komórek. Stwierdzono wydajność objętościową 76 kg/m3/h przy stężeniu kwasu mlekowego w odpływie. Produkcja kwasu mlekowego została zbadana przy użyciu immobilizowanych systemów komórkowych. Lactobacillus delbreuckii unieruchomiono w kulkach z alginianu wapnia i zastosowano w reaktorach kolumnowych o przepływie ciągłym, uzyskując wydajność 0,97 g/g kwasu mlekowego. Lactobacillus delbreuckii zostały unieruchomione w reaktorze z włóknami drążonymi. Zaobserwowano wydajność mleczanu na poziomie 100 kg/m3/h. Nadmierny wzrost organizmów ograniczał długotrwałą pracę układu reaktora. Kinetyka wzrostu i produkcji kwasu mlekowego przez Lactobacillus casei i Lactobacillus lactis była badana dla hydrolizatu lignocelulozowego z rozdrobnionych kolb kukurydzy w hodowli ciągłej z zatrzymaniem komórek, z modułem ultrafiltracyjnym zatrzymującym całą biomasę i pozwalającym na ciągłe usuwanie metabolitów (Melzoch i wsp. 1996). Biofilmy są naturalną formą immobilizacji komórek. Wykazano, że produkcja kwasu mlekowego była zwiększona, gdy fermentacja biofilmu była prowadzona z użyciem wiórów kompozytowego nośnika z tworzywa sztucznego PCS zawierającego 75% (w/w) polipropylenu (PP) i 25% (w/w) materiału rolniczego (Demirci i Pometto, 1995). Do fermentacji biofilmu kwasu mlekowego L (+) w podłożu minimalnym bez kontroli pH zastosowano 24 mieszanki PCS zawierające 50% (w/w) PP i 50% materiałów rolniczych. Każda mieszanka PCS była oceniana pod względem rozwoju biofilmu, powolnego uwalniania składników odżywczych, kąta kontaktu powierzchniowego, kompatybilności hydrofobowej z Lactobacillus casei, porowatości i absorpcji kwasu mlekowego. Krążek PCS, który konsekwentnie wykazywał najwyższą wydajność, zawierał 50% (w/w) PP, 35% (w/w) łusek sojowych, 5% (w/w) ekstraktu drożdżowego, 5% (w/w) suszonej albuminy wołowej i soli mineralnych. Na liczebność populacji biofilmu wpływa kąt kontaktu i względna hydrofobowość podłoży. Użycie plastikowych kompozytowych podpór dało wysoką populację biofilmu, gęstość komórek i stężenie kwasu mlekowego.
Ekstrakcja rozpuszczalnikowa była używana do oczyszczania kwasów karboksylowych takich jak kwas mlekowy i bursztynowy. Ale te rozpuszczalniki in-situ są toksyczne, ponieważ rozrywają błonę komórkową powodując wyciek metabolitu. Alkohole długołańcuchowe, takie jak 1-oktanol i 1-dekanol okazały się mniej toksyczne niż inne rozcieńczalniki. Wykazano również, że koloidalne ciekłe aprony (CCA) powodują niewielką różnicę w dystrybucji równowagowej w porównaniu z samym rozpuszczalnikiem. Zmniejszają one toksyczność rozpuszczalników na komórki.
Wysoką wydajność można uzyskać stosując reaktor z recyklingiem membranowym, ale ma on potencjalną wadę w postaci zacierania się. Przy wysokiej gęstości komórek komórki są narażone na stres i zaczynają produkować D-izomer produktu. Wysoką gęstość komórek można uzyskać stosując komórki unieruchomione, ale warunkiem koniecznym jest kontrolowane pH. Reaktor ze zbiornikiem mieszadłowym zapewnia skuteczną kontrolę pH, ale często prowadzi do ścierania się podpory. Adhezyjny szczep L. casei został zaszczepiony w dwóch reaktorach z wypełnieniem, które pracowały w sposób ciągły. W reaktorach ze złożem upakowanym generowane są duże gradienty pH i znaczna część komórek nie ma optymalnego pH. Adsorpcja na podłożu zapewnia prostsze i lepsze uwięzienie komórek. Namnażające się komórki są uwalniane do medium, co prowadzi do obecności komórek zawieszonych w medium (Bruno et al. 1999).
Kwas mlekowy L (+) jest produkowany komercyjnie w procesach fermentacyjnych z wykorzystaniem bakterii kwasu mlekowego lub grzybów takich jak Rhizopus oryzae w kulturach zanurzonych. Rhizopus sp. może produkować kwas L (+) mlekowy ze skrobi, ale wydajność jest bardzo niska w porównaniu z bakteriami kwasu mlekowego. Zastosowanie bioreaktora typu air-lift w optymalnych warunkach pozwala na produkcję kwasu L (+) mlekowego z wydajnością 85%. Morfologia grzybni nie sprzyja fermentacji, gdyż zwiększają one lepkość pożywki, owijają się wokół wirników i powodują zatory podczas pobierania próbek i w przewodach przelewowych. Regulując stężenie zarodników inokulowanych w hodowli wstępnej uzyskano małe granulki grzybni R. oryzae. Jednakże, granulki mają problem z niedostatecznym przenoszeniem masy. W celu uzyskania kłaczków o morfologii zbliżonej do bawełny można zastosować podpory mineralne (Sun et al. 1999).
Perfuzyjna hodowla mikroorganizmów jest efektywną techniką dla osiągnięcia wysokiej wydajności produktów pozakomórkowych. Stirred ceramic membrane reactor (SCMR) wyposażony w asymetryczną rurkę membranową okazał się skuteczny w utrzymaniu wysokiej przepuszczalności przez długi okres czasu. Jednakże, wydajność produkcji stopniowo spadała podczas powtarzanej fermentacji wsadowej. Niemniej jednak, długotrwała, wysoka wydajność filtracji SCMR umożliwiła uzupełnienie supernatantu hodowli w krótkim czasie (Ohashi et al. 1999).
Różne opcje separacji kwasu mlekowego / soli mleczanowych; zalety i wady
Sfermentowane medium zawiera albo czystą pomoc mlekową, albo jej sól, albo mieszaninę obu. Klasa korzystnych metod przetwarzania obejmuje usuwanie kwasu mlekowego z wywaru fermentacyjnego lub innej mieszaniny, przy jednoczesnym pozostawieniu rozpuszczalnego mleczanu w wywarze fermentacyjnym. Do oddzielenia soli mleczanowej z pożywki fermentacyjnej można zastosować szereg metod, takich jak ekstrakcja rozpuszczalnikami, separacja jonowymienna, separacja przez adsorpcję, separacja przez destylację próżniową oraz separacja membranowa (Eyal et al. 2001). Każdy z nich posiada pewne zalety i wady, które zostały również opisane w odniesieniu do procesów fermentacji we wcześniejszej części niniejszego przeglądu. Wybór procesu separacji powinien być oparty na efektywnym i ekonomicznym wykorzystaniu tych ekstrahentów (Roychoudhury et al. 1995).
Według Eyal et al. 2001; preferowany proces otrzymywania produktów kwasu mlekowego z mieszaniny zawierającej wolny kwas mlekowy i rozpuszczoną sól mleczanową składa się z następujących etapów: – (a) obniżenie pH fermentowanego bulionu (3,0 do 4,2); (b) zastosowanie membrany hydrofilowej i lotnej słabej zasady aminowej (VAWB) w celu oddzielenia kwasu mlekowego z fermentowanego bulionu poprzez membranę hydrofilową do VAWB; (c) regeneracja kwasu mlekowego z soli słabej zasady aminowej poprzez selektywne odparowanie lotnej zasady aminowej. Proces ten można powtarzać, aby zapewnić skuteczne oddzielenie wolnego kwasu mlekowego i jego soli.
Polimery kwasu mlekowego metodą polikondensacji
Polimery kwasu mlekowego składają się głównie z jednostek laktylowych, tylko jednej stereoizoformy lub kombinacji jednostek D i L laktylowych w różnych proporcjach. Wadą polikondensacji jest to, że otrzymuje się polimer o małej masie molowej. Prowadzono badania mające na celu otrzymanie polimeru o dużej masie molowej poprzez manipulowanie równowagą pomiędzy kwasem mlekowym, wodą i kwasem polimlekowym w rozpuszczalniku organicznym (Ajioka et al. 1995) lub stosowano wielofunkcyjny czynnik rozgałęziający w celu otrzymania polimerów o kształcie gwiazdy (Kim i Kim, 1999). W obecności środków dwufunkcyjnych (dipoli i diacydów) tworzą one polimery telecheliczne, które mogą być dalej łączone w celu uzyskania polimerów o wysokiej masie molowej przy użyciu środków łączących, takich jak diizocynian (Hiltunen et al. 1997). Przegląd różnych polimerów na bazie kwasu mlekowego przygotowanych przez polikondensację i polikondensację z przedłużeniem łańcucha podano w Tabeli 2.
Polimery kwasu mlekowego przez polimeryzację z otwarciem pierścienia
Scieżka polimeryzacji z otwarciem pierścienia obejmuje polikondensację kwasu mlekowego, po której następuje depolimeryzacja do odwodnionego cyklicznego dimeru, laktydu, który może być polimeryzowany z otwarciem pierścienia do polimerów o wysokiej masie molowej. Depolimeryzację prowadzi się zwykle poprzez podwyższenie temperatury polikondensacji i obniżenie ciśnienia, a następnie destylację wytworzonego laktydu. Polimeryzacja w roztworze, polimeryzacja luzem, polimeryzacja w stanie stopionym i polimeryzacja w zawiesinie to różne metody polimeryzacji z otwarciem pierścienia (Niewenhuis, 1992). Mechanizmem polimeryzacji może być polimeryzacja kationowa, anionowa, koordynacyjna lub wolnorodnikowa. Katalizowana jest ona przez związki metali przejściowych: cyny, glinu, ołowiu, cynku, bizmutu, żelaza i itru (Nijenhuis i in. 1992). W wyniku kopolimeryzacji z otwarciem pierścienia do polimeru na bazie kwasu mlekowego można również wprowadzić inne monomery tworzące pierścienie. Najczęściej stosowanymi komonomerami są glikolid, kaprolakton, walerolakton, dioksypenon i węglan trimetylu. Zaletą polimeryzacji z otwarciem pierścienia jest to, że chemizm reakcji może być dokładnie kontrolowany, co pozwala w bardziej kontrolowany sposób zmieniać właściwości otrzymanego polimeru.
Różni autorzy badali syntezę polimerów o różnym ciężarze cząsteczkowym. Stwierdzono, że wysokocząsteczkowy polikwas mlekowy może być syntetyzowany na drodze jednoetapowej polikondensacji, jeśli zastosuje się odpowiednie rozpuszczalniki azeotropowe. Stężenie katalizatora, czas polimeryzacji i temperatura mają ogromny wpływ na wydajność polimeru, ciężar cząsteczkowy i skręcalność optyczną.
Synteza kwasu polimlekowego poprzez polikondensację monomeru kwasu mlekowego dała średnie wagowe ciężary cząsteczkowe mniejsze niż 1,6 x 104, podczas gdy polimeryzacja z otwarciem pierścienia laktydów dała średnie ciężary cząsteczkowe w zakresie od 2 x 104 do 6,8 x 105 (Hyon et al. 1997). Konwersja monomeru i średnie ciężary cząsteczkowe wykazują maksimum przy stężeniu oktanianu cyny wynoszącym 0,05%. Wzrastają one liniowo wraz z czasem polimeryzacji aż do osiągnięcia maksymalnej konwersji monomeru wynoszącej 80%, ale przy dłuższym czasie w wyższych temperaturach polimeryzacji obserwuje się termiczną depolimeryzację powstałych polilaktydów.
Synteza kopolimerów gwiaździstych zależy od stosunku monomeru do inicjatora i monomeru do katalizatora oraz konwersji monomeru (Dong et al. 2001). W przypadku polimeryzacji polilaktydu z metyloglikolidem z zastosowaniem inicjatora trimetylolopropanowego zależy to od stosunku molowego monomeru do inicjatora i konwersji monomeru, w wyniku czego powstają polimery o kształcie trój- lub czteroramiennej gwiazdy.
Przeprowadzono interesujące badania dotyczące selekcji > 99:1 stereoizomerów kwasu mlekowego. Reakcje Dielsa-Aldera akrylanu mleczanu etylu z cyklopentadienem przebiegają z selektywnością diastereofazową do 85:15 (niekatalizowana) i 93:7 (promowana TiCL4). W zależności od kwasu lewisowego otrzymuje się produkty o odwrotnej konfiguracji. Może to posłużyć jako metoda do praktycznych zastosowań na dużą skalę asymetrycznej reakcji Dielsa Aldera. Stwierdzono statystycznie istotne wpływy względnego udziału laktydu i glikolidu w mieszaninie oraz stężenia katalizatora. Wpływ czasu, temperatury i alkoholu laurylowego na masę cząsteczkową, skład i strukturę łańcucha był również badany przez autorów (Dorta et al. 1993).
Postępy w produkcji kwasu mlekowego i polimerów na jego bazie
Postęp technologiczny w głównych składnikach procesu – fermentacji, oczyszczaniu pierwotnym i wtórnym, polimeryzacji, konwersji chemicznej kwasu mlekowego i jego pochodnych umożliwiłby tanią, wielkoseryjną i przyjazną dla środowiska produkcję kwasu mlekowego. Ostatnie postępy w separacji i oczyszczaniu opartym na membranach umożliwiłyby produkcję kwasu mlekowego bez wytwarzania soli lub produktów ubocznych w postaci gipsu. W ostatnio wydanych patentach, osmotolerancyjny szczep bakterii kwasu mlekowego i konfiguracja elektrodializy odsalającej, elektrodializy rozdzielającej wodę i oczyszczania przez wymianę jonową, skoncentrowany produkt kwasu mlekowego zawierający mniej niż 0,1% składników białkowych może być produkowany przez fermentację węglowodanów. Proces ten nie daje gipsu soli ubocznych, ale tylko niewielką ilość soli podczas regeneracji wymiany jonowej. Twierdzi również, że ma małe zapotrzebowanie na energię.
Ecochem, partnerstwo Dupont ConAgra opracowało proces odzyskiwania i oczyszczania, który wytwarza produkt uboczny sól amonową, która może być sprzedawana jako nawóz (Anon, 1992). Wydajność tego zakładu wynosi 1000 ton/rok. Opracowano proces ciągły do produkcji polimerów laktydu o kontrolowanej czystości optycznej (Gruber, 1992). Proces wykorzystuje konfigurację wieloetapowego odparowania, po którym następuje polimeryzacja do prepolimeru o niskiej masie cząsteczkowej, który jest następnie katalitycznie przekształcany w dylaktyd. Oczyszczony dylaktyd jest odzyskiwany w układzie destylacyjnym z częściową kondensacją i recyklingiem. Dilaktyd może być stosowany do wytwarzania polimerów i kopolimerów o dużym ciężarze cząsteczkowym. Opracowano nowy proces wytwarzania cyklicznych estrów, dylaktydu i glikolidu. Proces ten wykorzystuje gaz obojętny do usuwania cyklicznych estrów z masy reakcyjnej, a następnie odzyskuje i oczyszcza ulatniający się ester przez skruberowanie odpowiednim kwasem organicznym i w końcu oddziela cykliczny ester od cieczy przez wytrącanie lub krystalizację i filtrację fazy stałej, wytwarzając laktyd o wysokiej czystości z minimalnymi stratami spowodowanymi racemizacją. Stwierdzono, że recykling i ponowne wykorzystanie części składowych kwasu mlekowego w różnych strumieniach procesowych są wykonalne.
Technologia reakcji hydrogenolizy do produkcji alkoholu z kwasów organicznych lub estrów jest również ostatnio zaawansowana, nowe katalizatory i procesy dają wysoką selektywność i szybkość oraz działają przy umiarkowanych ciśnieniach. Technologia ta została skomercjalizowana do produkcji 1,4 butanodiolu, tetrahydrofuranu i innych czterowęglowych półproduktów chemicznych z bezwodnika maleinowego. W przyszłości takie technologie mogą być zintegrowane z niskokosztowymi procesami produkcji kwasu mlekowego do wytwarzania glikolu propylenowego i innych pośrednich związków chemicznych.
Polimery na bazie kwasu L-mlekowego mogą wytwarzać polimer, który jest liniowym homopolimerem o wielkości cząsteczkowej >70 kDa. Głównym obszarem zastosowania polimerów kwasu mlekowego są zastosowania medyczne, a wiele firm podjęło wysiłki w zakresie produkcji polimerów na bazie kwasu mlekowego i ich produktów. Te zastosowania medyczne obejmują jego wykorzystanie, jeśli przenoszenie różnych właściwości w zakresie wytrzymałości na rozciąganie, lepkość, czystość itp. Polimer kwasu mlekowego występuje w trzech różnych postaciach: stałej, która może być użyta do wypełnienia szczelin w kościach, stałej o wytrzymałości na rozciąganie do produkcji szwów (materiał szewny) oraz w postaci kleju, który jest stosowany głównie do łączenia błon lub cienkiej skóry u ludzi (Shikinami et al. 2002). Inną ważną właściwością kwasu mlekowego jest jego wysoka odporność na promieniowanie UV. Biosorbowalny klej lub lepka forma kwasu mlekowego składa się z kopolimeru dwóch lub więcej biosorbowalnych monomerów: – kwasu L-mlekowego z dioksanonem, z węglanem tri metylenu i z ekaprolaktonem.Dow Chemicals i Cargill posiadają największą firmę produkującą polilaktyd (PLA) o rocznej zdolności produkcyjnej 140 000 ton zlokalizowaną w Blair, USA (Anon, 1992). PLA jest produkowany przez ROP, a jego głównym zastosowaniem są włókna, materiały opakowaniowe i rozpuszczalniki. Posiada spółkę joint venture z PURAC, Holandia, do produkcji kwasu mlekowego w zakładzie mielenia kukurydzy. Nawiązała współpracę w zakresie rozwoju biznesu PLA z Mitsubishi Polymers. Apack, Niemcy, firma produkująca opakowania do żywności wykorzystuje technologię polilaktydową byłej firmy Nestle Chemicals we współpracy z Fortum Oyj, Finlandia (Kivimaki, 2000). Galactic, Belgia produkuje 1500 ton kwasu mlekowego rocznie z cukru buraczanego. Brussels Biotech, spółka zależna Galactic, pracuje nad aspektami badawczo-rozwojowymi produktów kwasu mlekowego (Bronnbann i Yoshida, 2000). Hycail, Holandia, spółka joint venture pomiędzy Dairy Farmers, USA i Holenderskim Uniwersytetem Państwowym w Groningen, planuje budowę zakładu pilotażowego do produkcji kwasu mlekowego o wydajności 400 ton rocznie z serwatki i przetwarzania kwasu mlekowego na PLA. Mitsui Chemicals, Japonia produkuje PLA na drodze bezpośredniej polikondensacji. Shimadzu Corporation, Japonia produkuje PLA metodą ROP. Birmingham Polymers, USA i Phusi, Francja to niektórzy z innych aktywnych producentów PLA (Ohrlander et al. 1999).
Badania nad materiałami związanymi z kwasem mlekowym przyciągnęły kilka uniwersytetów i instytutów w Europie, Azji i USA. Istnieje wiele zakładów produkujących kwas polimlekowy na małą skalę.
Gdy mówimy o czystych L (+) polimerach kwasu mlekowego, mamy tylko kilka nazw, takich jak Yipu, Dahuachem International, Sinochem Hebei Qinhuangdao Imp and Exp Corp., Zechem i Qingdao FTZ united international Inc. w Chinach; i PURAC, Macropore Biosurgery, ECOCHEM itp. w USA. Większość z nich stosuje półnaturalny proces produkcji polimerów kwasu mlekowego L (+). Proces ten obejmuje izolację kwasu mlekowego L (+) z jego mieszaniny reemisyjnej wytworzonej w procesie fermentacji poprzez zastosowanie procesu enzymatycznego do produkcji kwasu mlekowego L (+) z jego mieszaniny reemisyjnej, a następnie rozdzielenie przy użyciu drogich technik wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) (Oxoid, USA; i Cargill Co., USA).