Metody
Po zatwierdzeniu protokołu przez Komisję ds. Przeglądu Etycznego Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie, 25 zdrowych mężczyzn i kobiet (w wieku 18-45 lat) poproszono o udział w tym badaniu rozpoznawczym. Po wyrażeniu pisemnej świadomej zgody, przed przystąpieniem do badania przeprowadzono pełne badanie lekarskie, w tym test ciążowy dla kobiet w wieku rozrodczym. Ograniczono spożycie alkoholu i ksantyny do dwóch jednostek dziennie, od dwóch dni przed dniem badania. Ponadto uczestnicy powstrzymywali się od spożywania alkoholu, kofeiny i pokarmów i napojów zawierających ksantyny na 12 godzin przed dniem badania i w czasie jego trwania. Kobiety poinstruowano, aby stosowały barierowe środki antykoncepcyjne. W okresie badania nie wolno było przyjmować jednocześnie leków innych niż paracetamol.
To było podwójnie zaślepione, częściowo randomizowane, kontrolowane placebo badanie z zastosowaniem wzrastającej dawki GPI 5693, z minimalnym okresem przerwy w przyjmowaniu leku wynoszącym 48 godzin. Celem badania było osiągnięcie maksymalnego stężenia (Cmax) i pola powierzchni pod krzywą stężenia (AUC) w stężeniach wykazujących odwrócenie hiperalgezji w doświadczalnych modelach zwierzęcych.
Badanie przeprowadzono w panelach, z okresowymi analizami farmakokinetyki i bezpieczeństwa w celu dostosowania projektu kolejnych paneli. Czterech mężczyzn uczestniczących w panelu 1 otrzymało na czczo doustne dawki GPI 5693 wynoszące 100 mg, 300 mg i 750 mg, z losowo dobranym placebo. Do tego panelu dodano piąty dzień badania prowadzonego metodą otwartej próby w celu zbadania wpływu jedzenia na dawkę 750 mg. Po przeprowadzeniu analizy śródokresowej wybrano dawki dla panelu 2 (w którym również uczestniczyło czterech mężczyzn) wynoszące 300 mg, 750 mg, 1125 mg i placebo. Analizy okresowe dwóch pierwszych paneli dostarczyły wskazań na wpływ pożywienia na farmakokinetykę GPI 5693. Bezpieczeństwo i tolerancja leku u mężczyzn pozwoliły na włączenie kobiet do trzeciego otwartego panelu, badającego tolerancję i farmakokinetykę po podaniu pojedynczych doustnych dawek 1125 i 1500 mg w stanie odżywienia dla obu płci. W panelu 3, który składał się z sześciu kobiet i sześciu mężczyzn, nie mierzono żadnych efektów ze strony OUN.
Zapisywanie ruchów gałek ocznych, śledzenie adaptacyjne, kołysanie ciała i wizualne skale analogowe (VAS) zostały przećwiczone przed pierwszym dniem badania w celu zmniejszenia efektów uczenia się podczas badania. GPI 5693 podawano w postaci kapsułek 100 mg i 375 mg po nocy na czczo. Podczas wszystkich okazji dwóch pierwszych paneli bez interakcji z jedzeniem mierzono EEG, ruchy gałek ocznych, śledzenie adaptacyjne, kołysanie ciała i VAS na poziomie podstawowym i w odstępach 30 min przez pierwsze 2 h, a następnie w coraz większych odstępach czasu do 8 h po podaniu leku. Regularnie sprawdzano EKG, parametry życiowe oraz występowanie działań niepożądanych, a przez 4 h po podaniu leku prowadzono ciągłe monitorowanie dwuprzewodowego EKG. W okresie 24-48 h po podaniu leku pobierano próbkę kału w celu sprawdzenia obecności krwi utajonej. Próbki krwi do oznaczenia parametrów hematologicznych i biochemicznych pobierano na początku i 24 h po podaniu leku. Próbki farmakokinetyczne pobierano co 10 min przez pierwszą godzinę, a następnie w coraz większych odstępach czasu do 48 h po podaniu leku. GPI 5693 był mierzony za pomocą LC/MS/MS. Stężenia GPI 5693 w osoczu były liniowe w zakresie od 1 do 2000 ng ml-1, a stężenia GPI 5693 w moczu były liniowe w zakresie od 10 do 2000 ng ml-1. Średnie CV w obrębie oznaczenia wynosiło 2,5%, a średnie CV między oznaczeniami wynosiło 1,6%.
Przedmioty pozostawały w miejscu badania do 24 h po każdym podaniu dawki. Badanie kontrolne po zakończeniu badania miało miejsce 48 h po ostatnim dniu badania i obejmowało końcową obserwację wszelkich działań niepożądanych.
Elektroencefalogramy były rejestrowane i analizowane przy użyciu oprogramowania CED (Cambridge Electronics Design, Cambridge, UK), jak opisano wcześniej. Zapisów EEG dokonywano przy użyciu elektrod chlorkowo-srebrowych, mocowanych kolodionem w punktach Fz, Cz, Pz i Oz, z tą samą wspólną elektrodą uziemiającą, co do rejestracji ruchów gałek ocznych (system międzynarodowy 10/20). Rezystancje elektrod były utrzymywane poniżej 5 kOhm. Wszystkie zapisy wykonywano przy zamkniętych oczach badanych. Sygnały EEG uzyskiwano z odprowadzeń Fz-Cz i Pz-Oz. Sygnały wzmacniano za pomocą wzmacniacza bioelektrycznego Nihon Kohden AB-621G (Nihon Kohden Corporation, Tokio, Japonia) o stałej czasowej 0,3 s i filtrze dolnoprzepustowym 100 Hz. W każdej sesji rejestrowano osiem kolejnych bloków po 8 s w okresie 2 min. Częstotliwość próbkowania wynosiła 1024 Hz. Bloki danych zawierające artefakty zostały zidentyfikowane przez inspekcję wzrokową i zostały wyłączone z analizy. Szybką transformatę Fouriera analizowano w celu uzyskania sumy amplitud w zakresach częstotliwości delta- (0,5-3,5 Hz), theta- (3,5-7,5 Hz), alfa- (7,5-11,5 Hz) i beta (11,5-30 Hz). Całkowita szerokość pasma rejestracji wynosiła 0-50 Hz.
Rejestracja i analiza sakkadowych i płynnych ruchów gałek ocznych wykonywana była za pomocą systemu mikrokomputerowego. Sprzęt używany do wyświetlania bodźców, zbierania sygnałów i wzmacniania pochodził od firmy Nihon Kohden (Nihon Kohden Corporation, Tokio, Japonia). Sackadyczne ruchy gałek ocznych były rejestrowane dla amplitudy bodźca 15 stopni w każdą stronę. Odstępy między bodźcami zmieniały się losowo od 3 do 6 s, rejestrowano 15 sakkad. Jako parametry wykorzystano średnie wartości szczytowej prędkości sakkad, opóźnienia (czasu reakcji) i niedokładności. Dla płynnych ruchów gonitwy oczu cel poruszał się sinusoidalnie z częstotliwością od 0,3 do 1,1 Hz, wzrastającą z krokiem 0,1 Hz. Amplituda przemieszczenia celu odpowiadała 20-stopniowemu obrotowi gałki ocznej w obie strony. Cztery cykle zostały zarejestrowane dla każdej częstotliwości bodźca.
Test adaptacyjnego śledzenia został przeprowadzony zgodnie z pierwotnym opisem przez Borlanda i Nicholsona, przy użyciu dostosowanego sprzętu i oprogramowania (Hobbs, 2000, Hertfordshire, Wielka Brytania). Do analizy wykorzystano średnią wydajność i odchylenie standardowe wyników z okresu 10 minut. Śledzenie adaptacyjne jest zadaniem polegającym na śledzeniu pościgu. Okrąg porusza się losowo po ekranie. Osoba badana jest instruowana, by starała się utrzymać kropkę wewnątrz poruszającego się okręgu za pomocą joysticka. Jeśli wysiłek ten zakończy się sukcesem, prędkość poruszającego się okręgu wzrasta. I odwrotnie, prędkość jest zmniejszana, jeśli osoba badana nie jest w stanie utrzymać kropki wewnątrz okręgu. Wydajność była oceniana po ustalonym 10-minutowym okresie. Test adaptacyjnego śledzenia jest bardziej wrażliwy na upośledzenie koordynacji oko-ręka przez leki niż zadania kompensacyjnego pościgu lub inne zadania śledzenia pościgu, takie jak rotor pościgowy. Test adaptacyjnego śledzenia okazał się przydatny do pomiaru wpływu alkoholu, różnych leków psychoaktywnych i deprywacji snu na OUN.
Miernik kołysania ciała umożliwia pomiar ruchów ciała w jednej płaszczyźnie, zapewniając miarę stabilności postawy. Kołysanie ciała było mierzone za pomocą urządzenia podobnego do ataksjometru Wrighta. Dzięki sznurkowi przymocowanemu do talii, wszystkie ruchy ciała przez pewien okres czasu zostały zintegrowane i wyrażone jako mm kołysania na cyfrowym wyświetlaczu. Udział wzroku w kontroli postawy ciała został wyeliminowany poprzez poproszenie badanych o zamknięcie oczu. Osoby badane zostały poinstruowane, aby podczas każdej sesji nosiły tę samą parę wygodnych butów na niskim obcasie. Przed rozpoczęciem pomiaru poproszono badanych, aby stanęli nieruchomo i wygodnie, ze stopami w odległości około 10 cm od siebie i rękami w rozluźnionej pozycji wzdłuż ciała. Osobom badanym nie wolno było rozmawiać podczas pomiaru. Całkowity czas pomiaru kołysania ciała wynosił 2 minuty
Wizualne Skale Analogowe, opisane pierwotnie przez Norrisa, zostały użyte do ilościowego określenia subiektywnych efektów. Z tych pomiarów wyprowadzono trzy czynniki, opisane przez Bonda i Ladera, odpowiadające czujności, nastrojowi i spokojowi. Efekty psychodeliczne monitorowano za pomocą wizualnych skal analogowych, przetłumaczonych ze skal opisanych przez Bowdle’a i wsp. , ponieważ nie była dostępna żadna zwalidowana wersja dla języka holenderskiego i populacji holenderskiej.
Wszystkie wielokrotnie mierzone zmienne dynamiczne charakteryzowano za pomocą maksymalnej zmiany w stosunku do wartości przed leczeniem (Emax) i za pomocą obszarów pod krzywą efektu (AUEC). Te AUEC zostały obliczone przy użyciu liniowej reguły trapezowej i zostały podzielone przez odpowiedni przedział czasu, co dało średni ważony wynik. Zastosowano czasy nominalne. AUEC obliczono dla całego okresu próbkowania (12 h) i dla pierwszych 6 h, ponieważ oczekuje się, że większość odpowiedzi wystąpi w tym okresie.
Statystyki opisowe uzyskano dla każdego parametru farmakodynamicznego. Przebieg czasowy oraz parametry pochodne podsumowano (stosując średnie, odchylenie standardowe (SD), min, medianę, max, n). Pochodne parametry farmakodynamiczne analizowano w postaci nieprzekształconej. Parametry EEG analizowano jako procentową zmianę w stosunku do wartości wyjściowej. Parametry te analizowano, wyłącznie w przypadku podawania na czczo, z zastosowaniem analizy wariancji (anova) uwzględniającej uczestnika i leczenie.
Parametry niezależne od dawki (klirens, Cmax/dawkę, AUC0-inf/dawkę i tmax) porównywano pomiędzy podawaniem na czczo i w przypadku karmienia, stosując analizę kowariancji z pokarmem i uczestnikiem jako czynnikami, dawką jako zmienną i z uwzględnieniem interakcji dawka-posiłek. W ten sposób uzyskano przewidywaną liniową zależność między dawką a parametrem farmakokinetycznym (PK) oddzielnie dla karmienia i karmienia na czczo. Linia ta została przedstawiona na wykresach poszczególnych parametrów PK (klirens, Cmax/dawkę, AUC0-inf/dawkę i tmax) wykreślonych względem dawki, aby zobrazować zarówno zależność od dawki, jak i potencjalne różnice między okazjami stosowania na czczo i na czczo. Linia została obliczona z wykorzystaniem podanych średnich najmniejszych kwadratów (przy średniej podawanej dawce: 907,5 mg) wraz z nachyleniami w zależności od dawki dla dwóch grup (karmionych/odżywianych). W przypadku braku istotnej interakcji między dawką a pożywieniem, model anova został ponownie obliczony przy założeniu braku interakcji i w takim przypadku wynikowe (równoległe) linie są pokazane na wykresach.
Obliczenia statystyczne wykonano przy użyciu programów SPSS for Windows (SPSS, Inc., Chicago, IL) i SAS for Windows V8.1 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).
Parametry farmakokinetyczne obliczono za pomocą standardowej analizy niekompartmentowej przy użyciu pakietu oprogramowania WinNonlin V3.1 (Pharsight, Inc., Mountainview, CA, USA).
Wyniki obliczeń zostały przedstawione w tabeli 1.