Abstrakt
Tło. Poprzednio odkryliśmy, że kobiety z pozytywnym wynikiem przeciwciał antycentromerowych wykazywały upośledzony potencjał dojrzewania oocytów i rozszczepiania zarodków; możliwy mechanizm stojący za tym zjawiskiem był wciąż nieznany. Cel pracy. Tak więc, obecne badanie miało na celu wstępne zbadanie, czy ACA może przenikać do żywych zarodków i upośledzać ich potencjał rozwojowy poprzez kokulturę in vitro z embrionami myszy. Metody. Embriony myszy pobierano i używano do hodowli in vitro z poliklonalnym przeciwciałem antycentromerowym białka A (CENP-A); następnie wykonywano test immunofluorescencji w celu określenia penetracji przeciwciała do embrionów i obserwowano potencjał rozwojowy embrionów. Wyniki. Wszystkie embriony hodowane z przeciwciałem anty-CENP-A wykazywały immunofluorescencję na jądrze, podczas gdy żaden z embrionów z grup kontrolnych nie wykazywał immunofluorescencji. Dodatkowo, zarodki hodowane z przeciwciałem anty-CENP-A wykazywały znaczne upośledzenie wzrostu w porównaniu z grupą kontrolną. Wnioski. Zarodki myszy mogą być bezpośrednim celem dla ACA in vitro przed implantacją. Jednak dokładny mechanizm wymaga dalszego wyjaśnienia.
1. Wprowadzenie
W ostatnim badaniu ujawniono zaburzenia dojrzewania oocytów i wczesnego rozwoju zarodka u kobiet z dodatnim wynikiem przeciwciał antycentromerowych (ACA) we krwi obwodowej. Niedawno odkryliśmy, że kobiety z pozytywnym wynikiem na obecność ACA miały znacząco niższy odsetek dojrzałych oocytów i wskaźnik rozszczepiania zarodków w porównaniu z kobietami z negatywnym wynikiem na obecność ACA, co dodatkowo ujawnia potencjalny wpływ ACA na płodność kobiet. Wiadomo, że ACA jest jednym z członków ANA. Po raz pierwszy został odkryty w 1980 roku jako specyficzne przeciwciało przeciwko centromerom w surowicy pacjentów z zespołem kalcynozy, objawem Raynauda, dysmotalnością przełyku, sklerodaktylią i teleangiektazją (CREST). Obecnie ACA jest uznawany za skuteczny pomocniczy marker diagnostyczny twardziny układowej (systemic sclerosis – SSc). Jak donoszono, pacjentki z SSc są podatne na kilka różnych niekorzystnych wyników ciąży, w tym zwiększony odsetek spontanicznych poronień, przedwczesne porody, małe dzieci i niepłodność. Dodatkowo, częstość występowania niepłodności u pacjentów z SSc jest wysoka, a wskaźnik sukcesu w leczeniu niepłodności jest stosunkowo niski, co wymaga dalszych badań .
Już w latach 90. badacze próbowali mikroiniekcji ACA do jaj myszy, co doprowadziło do zaburzeń ruchu chromosomalnego i segregacji. Wiadomo, że kinetochor jest miejscem przyłączenia mikrotubul wrzeciona w regionie centromerowym chromosomu. Jest to również dynamiczna struktura dla mitozy, mejozy i innych ważnych działań komórek. W związku z tym można wnioskować, że ACA może zakłócać mejozę lub mitozę w żywych komórkach.
Centromer jest kompleksem DNA-białko, a jego montaż jest koordynowany przez chromatyny centromerowe i związany z nimi kompleks białkowy. Białko centromerowe A (CENP-A) jest jednym z konstytutywnych białek centromerowych o stosunkowo jasnych funkcjach biologicznych, które były najczęściej badane; jego ważna rola w montażu i funkcjonalnej realizacji centromeru była wielokrotnie weryfikowana. Co więcej, podobnie jak CENP-B, CENP-A jest uważany za główny antygen docelowy ACA .
Spekulowano, że ACA może być jednym z ANA najsilniej związanych z nieprawidłowym dojrzewaniem oocytów i rozszczepianiem zarodków. Dlatego też celem niniejszej pracy było zbadanie potencjalnego wpływu ACA na wczesne zarodki poprzez kokulturę in vitro z embrionami myszy.
2. Materiały i Metody
2.1. Zarodki myszy
Nadowulację indukowano u myszy ICR poprzez stymulację gonadotropiną surowicy ciężarnej klaczy (10 IU dootrzewnowo (i.p.)) i ludzką gonadotropiną kosmówkową (10 IU i.p. po 48 h) i kojarzono z samcami ICR. Samice myszy uśmiercano 24 h po kryciu. Wczesne zarodki pobierano przez ostre rozcięcie jajowodów i wykorzystywano w eksperymentach. Komitet Etyczny Pierwszego Szpitala Stowarzyszonego z Uniwersytetem Sun Yat-Sen zatwierdził te badania.
2.2. Kultura zarodków in vitro
Zarodki hodowano w podłożu Quinn’a (Sage, USA). Dla grupy przeciwciał, do pożywki dodano królicze poliklonalne przeciwciało do mysiego CENP-A (albumina surowicy bydlęcej i bez azydku, produkty na zamówienie firmy Abcam, Wielka Brytania). Stężenie przeciwciała w pożywce wynosiło 35 μg/mL (zmodyfikowane na podstawie literatury). Dla grupy soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (służyła jako kontrola), do pożywki dodawano roztwór PBS (tabletka PBS, Millipore, Merck, Niemcy) o takiej samej objętości jak roztwór przeciwciała. Ślepa grupa kontrolna zawierała pożywkę bez żadnych dodatków.
2.3. Badanie immunofluorescencyjne
W drugim i trzecim dniu hodowli, z każdej szalki z trzech grup wybierano trzy do pięciu zarodków do badania immunofluorescencyjnego, w celu wykrycia, czy sygnały przeciwciała anty-CENP-A były obecne w zarodkach po kokulturze. Procedury badania immunofluorescencyjnego były następujące: Zarodki utrwalano w 4% polioksymetylenie, a następnie przesączano 0,5% Tritonem X-100 (Sigma, USA), po czym zamykano w 5% normalnej surowicy oślej (Jackson Immunoresearch, USA). Następnie zarodki inkubowano przez 1 h z 488-wybarwioną oślą IgG antyrabbitową (Invitrogen, Wielka Brytania, rozcieńczenie 1 : 1000), płukano, inkubowano z 1 μg / mL DAPI (4,6-diamidino-2-fenyloindol, dihydrochlorek, Cell Signaling Technology, USA) przez 15 min, ponownie płukano i utrwalano w naczyniu do późniejszej obserwacji mikroskopowej. W celu wykluczenia fałszywie pozytywnych wyników grupy eksperymentalnej, zarodki z grupy z przeciwciałami inkubowano z PBS zamiast z przeciwciałami IgG znakowanymi 488 donkey antirabbit (grupa z przeciwciałami dla kontroli).
2.4. Rozwój hodowanych zarodków (badanie embriotoksyczności)
Zbieranie i hodowanie zarodków do tego badania embriotoksyczności było takie samo jak opisane wcześniej, z tym wyjątkiem, że zarodki pozostawały w szalkach przez cały okres 3 dni. Zarodki w każdej grupie badano w celu określenia ich stadium rozwoju w trzecim i piątym dniu (pierwszy dzień odnosił się do dnia pobrania oocytów). Odnotowano następujące stadia rozwojowe: stadia 6- do 8-komórkowe w trzecim dniu, oraz blastocysta, morula, stadia 2-8-komórkowe i atretyczne w piątym dniu.
2.5. Analiza statystyczna
Analiza statystyczna została przeprowadzona przy użyciu programu SPSS 13 (SPSS, IL, USA). Do porównania danych jakościowych użyto testu chi kwadrat i testu partycji chi kwadrat. Wartość mniejsza niż 0,05 została uznana za statystycznie istotną w teście chi kwadrat między trzema grupami, a wartość mniejsza niż 0,0167 została użyta do wskazania istotności statystycznej w partycji testów chi kwadrat między grupami.
3. Wyniki
3.1. Immunofluorescencja
Wszystkie zarodki hodowane z przeciwciałem anty-CENP-A wykazywały silną immunofluorescencję w swoich jądrach, podczas gdy żaden z zarodków z grup kontrolnych PBS i pustych, jak również z grupy przeciwciał dla kontroli, nie wykazywał immunofluorescencji (Rysunek 1).
3.2. Badanie embriotoksyczności
W porównaniu z grupami kontrolnymi PBS i pustą kontrolą, procenty zarodków w stadium 6- do 8-komórkowym w trzecim dniu, a także zarodków w stadium blastuli i moruli w piątym dniu, były znacznie niższe w grupie przeciwciał. Potencjały rozwojowe zarodków były porównywalne między grupami kontrolnymi PBS i pustymi (Tabela 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Pierwszy dzień odnosił się do dnia pobrania zarodków. została uznana za statystycznie istotną pomiędzy trzema grupami. a versus grupy z przeciwciałami i PBS. b versus grupy z przeciwciałami i ślepą kontrolą. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Dyskusja
W 1999 roku badacze stwierdzili, że wszystkie zarodki myszy hodowane z oczyszczoną przeciwjądrową IgG wykazywały silną immunofluorescencję na komórkach zarodka i doświadczały znacznego upośledzenia wzrostu lub śmierci w porównaniu z tymi hodowanymi z kontrolnymi immunoglobulinami . Wskazywało to, że ANA mogą wiązać się bezpośrednio z embrionami in vitro. Jednak dokładne epitopy nie były znane, ponieważ w zonie nie znaleziono antygenów jądrowych ani fosfolipidów. W zarodkach myszy w stadium 2-komórkowym dochodzi do przejściowej syntezy zestawu nukleoprotein i zmian w składzie chromatyny zarodka, co sugeruje, że wczesne zarodki mogą posiadać epitopy dla ANA . Co więcej, wiązanie to jest stosunkowo specyficzne, gdyż przeciwciała przeciwtarczycowe i przeciwciała pochodzące od zdrowych osobników nie wykazują dowodów na wiązanie się z zarodkami. Mikroiniekcja surowicy zawierającej ACA do oocytów myszy może utrudniać kongresję chromosomów i powodować zatrzymanie mejotyczne w interfazie lub zatrzymanie mitotyczne w prometafazie.
W obecnym badaniu wszystkie zarodki hodowane z poliklonalnym przeciwciałem anty-CENP-A wykazywały silną immunofluorescencję przeciwciał przeciwko składnikom jądrowym (które, jak przypuszczano, były przeciwciałami anty-CENP-A) i doświadczały widocznego upośledzenia wzrostu zarodka, co wskazuje, że zarodki myszy mogą być bezpośrednim celem dla niektórych ACA in vitro przed implantacją. Ponadto, w przypadku większości kokulturowanych embrionów, zawsze tylko jeden lub niektóre blastomery wykazywały fluorescencję. Być może, gęstość struktur w i wokół centromeru uniemożliwia dostęp przeciwciał anty-CENP-A, lub blastomer z wykrywalną fluorescencją był skłonny do apoptozy i wykazywał stosunkowo luźne struktury, które umożliwiały dostęp przeciwciał anty-CENP-A. Jednak dokładny mechanizm wymaga dalszego wyjaśnienia.
Mimo, że nie istnieje ostateczna koncepcja wnikania przeciwciał do żywych komórek, a mechanizm z tym związany jest jeszcze nieznany, badania te dostarczyły dowodów na wnikanie przeciwciał do żywych komórek. Na przykład, anty-rybonukleoproteina-IgG mogła selektywnie wnikać do limfocytów T, podczas gdy stosunkowo mniej receptorów Fc było obecnych na powierzchni limfocytów T. Sugerowało to jakieś inne mechanizmy związane z wnikaniem przeciwciał do żywych komórek. Sugerowało to, że niektóre inne mechanizmy istotne dla regulacji nie-Fc mogą być zaangażowane, które mogą być związane z antygenopodobnymi strukturami na powierzchni limfocytów, sugerując, że przeciwciała rybonukleoproteinowe oddziaływały z antygenami rybonukleoproteinowymi na powierzchni komórki, aby regulować ich dostęp do żywych komórek.
W badaniu tym stwierdzono również, że potencjał rozwojowy zarodków był znacznie upośledzony po hodowli z przeciwciałem anty-CENP-A, wykazując znacznie niższy odsetek zarodków w stadium 6- do 8-komórkowym w trzecim dniu i zarodków w stadium blastuli w piątym dniu. W rzeczywistości, w poprzednim badaniu stwierdzono, że embriony myszy hodowane z oczyszczoną IgG z surowicy ANA-pozytywnej wykazywały znacznie upośledzony potencjał rozwoju embrionalnego . ANA może przenikać do struktur subkomórkowych zawierających odpowiednie antygeny, gdzie może identyfikować i wiązać się z epitopami w ważnych regionach funkcjonalnych. Te autoprzeciwciała mogły znacząco hamować funkcję antygenów zarówno in vivo, jak i in vitro .
W podsumowaniu, embriony hodowane z przeciwciałem anty-CENP-A doświadczyły znacznego upośledzenia wzrostu lub śmierci. Tak więc, embriony mogą być bezpośrednim celem dla przeciwciała anty-CENP-A.
Zatwierdzenie etyczne
Medical Ethics Committee of The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University zatwierdził badanie (nr 75).
Konflikt interesów
Ying Ying, Xi Guo, Yiping Zhong i Canquan Zhou deklarują, że nie mają konfliktu interesów.
Podziękowania
Badanie to było wspierane przez National Natural Science Foundation of China (nr 81701518), Guangzhou Science and Technology and Information Bureau (nr. 2014J4100161), Science & Technology Project of Guangdong Province (no. 2013B021800271), and Population and Family Planning Commission of Guangdong Province (no. 20132048). Badanie to było wspierane przez Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Province z The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University. Badanie było również wspierane przez dwa kluczowe laboratoria z The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University; były to Key Laboratory for Major Obstetric Diseases of Guangdong Province oraz Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes.
.