Sposób, w jaki białka Rb kontrolują proliferację komórek nie jest do końca poznany. Ustalono, że białko RB wiąże się z wieloma różnymi czynnikami transkrypcyjnymi i kompleksami związanymi z chromatyną.
Białko Rb hamuje zdolność aktywacji transkrypcyjnej czynników E2F, maskując domenę aktywacji transkrypcyjnej i w niektórych przypadkach przekształcając czynniki E2F w represory transkrypcji. O znaczeniu interakcji Rb-E2F w kontroli wzrostu komórek świadczy odkrycie, że wszystkie naturalnie występujące mutacje Rb wyizolowane z ludzkich guzów pozbawione są zdolności wiązania i negatywnej regulacji E2F (Qian i in., Uważa się, że białka Rb hamują ekspresję genów regulowanych przez E2F na dwa sposoby (Dyson i in., 2002): przez bezpośrednie wiązanie i blokowanie domeny aktywacyjnej białek E2F lub przez aktywną represję poprzez rekrutację HDAC, czynników SWI/SNF, białek grupy Polycomb (Dahiya i in., 2001) lub metylotransferaz (Vandel i in., 2001).
Wiązanie z czynnikami transkrypcyjnymi E2F
Rodzina czynników transkrypcyjnych E2F składa się z co najmniej siedmiu członków rodziny E2F, E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, 2A7E i E2F7.
Funkcjonalny czynnik transkrypcyjny E2F składa się z heterodimeru zawierającego polipeptyd E2F i polipeptyd DP (Helin i in., 1993). Każdy z polipeptydów E2F może heterodimeryzować z DP1 lub DP2 (DP3) (Ormondroyd i in., 1995), chociaż czynnik transkrypcyjny E2F7 wiąże DNA w sposób niezależny od DP.
W obrębie rodziny E2F występują różnice funkcjonalne i strukturalne. E2F1, E2F2 i E2F3 są aktywatorami transkrypcji, które oddziałują z pRB. E2F4 i E2F5 są represorami transkrypcji i wiążą się głównie z Rb2/p130 i p107 (Gaubatz i in., 2000). 2A7E wydaje się nie posiadać domeny interakcji z białkami kieszonkowymi; oddziałuje z białkami Polycomb i represjonuje transkrypcję (Morkel i in., 1997). Uważa się, że niedawno zidentyfikowane E2F7 i E2F8 również mogą represjonować specyficzne promotory (Di Stefano i in., 2003). Nie wydaje się, aby partner heterodimeryzacji DP determinował specyficzno¶ć wi±zania się czynników E2F z białkami kieszeniowymi. Jednakże czynniki DP funkcjonuj± w stabilizacji interakcji pomiędzy czynnikami E2F a białkami Rb (Helin i in., 1993).
Podczas odpowiedzi proliferacyjnej komórek dochodzi do zróżnicowanej ekspresji różnych E2F, przy czym wzrost E2F3 obserwuje się we wczesnym okresie G1 do połowy G1, a E2F1 i E2F2 wzrastaj± na granicy G1/S (Johnson i in., 1998). E2F4 i E2F5 ulegają ekspresji w całym cyklu komórkowym, ale w G0 i wczesnym G1 są wiązane do jądra przez p107 i Rb2/p130, tworząc kompleksy represorów transkrypcyjnych. p107 i Rb2/p130 rekrutują E2F4 do jądra komórki, indukując represję transkrypcji genów fazy S i proliferacji komórek. Tymczasem uważa się, że pRb wiąże E2F1-3 albo przy promotorach odpowiadających E2F, albo sekwestrowanych z dala od nich (De La Luna i in., 1996).
Po stymulacji, komórki quiescent wchodzą w cykl komórkowy, a w fazie wczesnego G1 pRb ulega fosforylacji i w konsekwencji uwalniane są czynniki transkrypcyjne E2F1-3, natomiast dopiero w połowie G1 do późnego G1 obserwuje się utratę kompleksów Rb2/p130. Dlatego też w późnej fazie G1 białka Rb ulegają fosforylacji i dysocjacji z E2F; E2F4 i E2F5 przemieszczają się do cytoplazmy, a E2F1-3 wiążą się do promotorów odpowiadających E2F w miejscach, które często różnią się od miejsc wiązania białek represorowych E2F (Cinti i in., 2000). Przy przej¶ciu w fazę G1/S, kompleksy zawieraj±ce p107 w asocjacji z E2F4 mog± być wci±ż wykrywane (Mudryj, 1991). Te kompleksy E2F4-p107 zawierają również cyklinę E lub A oraz cdk2 (Shirodkar, 1992). Wykazano również, że kompleksy E2F-p130 gromadzą się, gdy niektóre typy komórek, w tym mioblasty i melanocyty, przechodzą terminalne różnicowanie (Shin i in., 1995).
PRb i związane z nim białka p107 i Rb2/p130 nie pełnią w pełni redundantnej funkcji w regulacji transkrypcji genów E2F; wykazują natomiast dużą redundancję na poziomie cyklu komórkowego. Na przykład, w fibroblastach pRb-/- występuje kompensacyjny wzrost poziomu białka p107 podczas zatrzymania w fazie G0/G1 (Sage i in., 2003). Mechanizm tego antyproliferacyjnego działania p107 nie jest znany – p107 może zastępować pRb w regulacji E2F1-3 lub może represjonować niektóre geny reagujące na E2F, które są kontrolowane przez pRb (Lee i in., 2002). Co więcej, pRb może również wiązać E2F4 in vitro, ale nie reguluje promotora odpowiedzialnego za E2F w komórkach p107-/- i p130-/-. Wykazano, że kompleks pRb-E2F4, w komórkach p107-/-, nie wiąże tych samych miejsc promotorowych, które są zwykle łączone przez kompleks p107-E2F4 w komórkach typu dzikiego (Rayman i in., 2002).
Jednakże pRb jest zaangażowany w represję ograniczonego zestawu genów E2F w komórkach G0 i G1, a ostatnio określono jego rolę w represji genu cykliny E. Promotor cykliny E jest w istocie zderegulowany w komórkach, które utraciły pRb, mimo że kompleks p107/p130-E2F4 jest nadal dostępny (Herrera i in., 1996). pRb pośredniczy w represji promotora cykliny E poprzez rekrutację HDAC i metylotransferazy histonowej na określonym miejscu E2F-SP1, które jest połączone wyłącznie przez kompleksy pRb-E2F1-3. Cyklina E ulega derepresji nie tylko przez utratę pRb, ale także przez utratę białek E2F1-3, jest więc jasne, że białka E2F1-3 działają w tym przypadku jako represory, a nie aktywatory (Wu i in., p107 lub Rb2/p130 mogą zastąpić pRb tylko wtedy, gdy są obecne w ilości wystarczającej do związania białek E2F1-3 (Lee i in., 2002).
PRb może hamować proliferację poprzez mechanizm niezależny od E2F. Na przykład, pRb może indukować powstawanie ciał jądrowych w białaczce promielocytowej (PML) (Fang i wsp., 2002), zwiększać ekspresję p27 (patrz wyżej), hamować sygnalizację Ras (Lee i wsp., 2002) i współpracują z hLin-9, białkiem zaangażowanym, podobnie jak pRb, w hamowanie transformacji, ale w sposób niezależny od E2F (Gagrica i in., 2004).
Kompleksy represorowe RB/E2F mogą być również regulowane w sposób niezależny od Cdk. Na przykład, transformuj±cy czynnik wzrostu-β rekrutuje E2F4/p107 i E2F5/p107 przez promotor c-myc niezależnie od fazy komórki i jest to nadal stabilne w obecno¶ci wysokiej aktywno¶ci Cdk (Chen i in., 2004). W komórkach ludzkich zauważono, że p107 i p130 są usuwane z promotorów genów regulowanych przez cykl komórkowy w fazie S, ale nadal znajdują się przy promotorach genów apoptotycznych (Young i in., 2004). Regulacja kompleksu RB/E2F w sposób niezależny od Cdk nie jest jeszcze dobrze poznana.
Wiązanie z białkami modyfikującymi strukturę chromatyny
Represja przez białka Rb wymaga konserwowanych domen A i B białka kieszeniowego i wydaje się obejmować asocjację innych białek oprócz czynników E2F. Białka Rb represjonują transkrypcję poprzez przebudowę struktury chromatyny poprzez interakcję z białkami takimi jak hBRM, BRG1, HDAC1 i SUV39H1 (Shao i in., 1995), które są odpowiednio zaangażowane w przebudowę nukleosomów, acetylację/deacetylację i metylację histonów.
hBRM i BRG1 są ssaczymi homologami składników kompleksu przebudowy chromatyny drożdży SNF2/SWI2 (Strober i in., 1996). Wykazano, że zarówno BRG1 jak i hBRM wiążą się z pRB i są zaangażowane w represję indukowaną przez pRb. Fizyczna interakcja pomiędzy pRb i BRG1 nie jest wymagana do zatrzymania wzrostu indukowanego przez pRB i transkrypcyjnej represji genów docelowych E2F (Kang i in., 2004).
Deacetylaza histonowa 1 jest HDAC, która, jak ostatnio wykazano, jest rekrutowana do kompleksów E2F przez pRb i funkcjonuje w represji ekspresji genu cykliny E (Magnaghi-Jaulin i in., 1998). Histony są generalnie hiperacetylowane przy promotorach aktywnie transkrybowanych genów, natomiast są hipoacetylowane przy genach wyciszonych. Deacetylaza histonów jest generalnie rekrutowana do promotorów genów przez wiele regulatorów transkrypcji. pRB wiąże się z aktywnością HDAC in vivo i wiąże się z HDAC klasy I (HDAC1-HDAC3) in vitro. Represja pRB jest wzmacniana przez HDAC1 w eksperymentach transfekcji przejściowej, a w celu potwierdzenia tego związku między pRb i HDAC wykazano, że hamowanie aktywności HDAC za pomocą trichostatyny A zakłóca represję pRB na podzbiorze promotorów regulowanych przez E2F (Zhang i in., 2000). Deacetylaza histonów jest więc zaangażowana w modulowanie represyjnej aktywności pRb na promotorach genów E2F. Rekrutacja HDAC może być pośrednia i towarzyszyć jej rekrutacja innych białek wiążących, takich jak RBP1, corepressory i białka remodelujące chromatynę (Lai i in., 1999). Rayman i wsp. (2002) wykazali, że w komórkach Rb-/-, HDAC znajduje się na promotorach genów E2F; pozwoliło nam to wysunąć hipotezę, że pRb nie jest ściśle niezbędny w represji transkrypcyjnej E2F, ale że mogą być w nią zaangażowane inne mechanizmy. Białka acetylotransferazy histonowej (CCBP, p300, Tip6, itd.) uczestniczą w aktywacji białek E2F (Condorelli i Giordano, 1997); oddziałują one z domeną aktywacyjną białek E2F i stymulują ich aktywację.
SUV39H1 jest metylotransferazą, która specyficznie metyluje K9 histonu H3 i współpracuje z pRb w represji promotora genów odpowiadających na E2F. W komórkach pozbawionych pRB nie obserwuje się asocjacji me-K9-H3 w tych promotorach (Rea i in., 2000); w szczególności wyniki te zostały rozwinięte poprzez badanie cykliny E, jednego z najlepszych genów docelowych E2F modulowanych przez pRb. Zarówno pRb, jak i SUV39H1 są bezpośrednio zaangażowane w represję transkrypcji cykliny E, ponieważ zarówno w komórkach pRb-/-, jak i SUV39H1-/- z podwójnym nokautem, cyklina E ulega nadekspresji. Białka Rb są również w stanie zapobiegać tworzeniu kompleksów preinicjacyjnych, hamując aktywność czynników transkrypcyjnych rekrutujących się na promotorach genów E2F (Ross i in., 1999).
Typ represji, jaką białka Rb wywierają na wzrost komórek, zależy od rodzaju białek rdzeniowych, które wiążą geny docelowe E2F. Na przykład, różne typy represji transkrypcyjnej mogą działać przy tym samym promotorze w innym stanie komórkowym lub w innym fenotypie komórkowym (Dimova i Dyson, 2005).
Kompleks pRb/E2F może również promować stabilną represję niezależnie od pozycji w cyklu komórkowym lub będąc odpornym na progresję cyklu komórkowego. Niestety, mechanizmy, poprzez które pRb jest zaangażowany w procesy, które trwale represjonują transkrypcję zależną od E2F nie są do tej pory dobrze poznane. Na przykład, E2F4 można znaleźć przy promotorach regulowanych przez E2F w fazie S, ale nie jest jasne, czy działa on jako aktywator. Komórki starzejące się, na przykład, wykazują wyższy poziom metylacji H3K9 w promotorach regulowanych przez E2F w porównaniu z komórkami w fazie spoczynku (Narita i in., 2003). Białka Rb s± mediatorami genów reaguj±cych na E2F zarówno w stanie quiescent, jak i senescent/dyferencjacji, przy czym ten pierwszy stan charakteryzuje się niskim poziomem metylacji H3K9, a drugi wysokim poziomem metylacji H3K9. Tożsamość metylotransferazy histonowej, która jest rekrutowana na promotorze, może również modulować przejście między komórką w stanie spoczynku a komórką w stanie senescencji/różnicowania.
.