DISCUSSION
Całkowity czas resorpcji as-polimeryzowanego PLLA został oszacowany w poprzednich badaniach na 3,5 roku15,16. Wyniki tego eksperymentu pokazują, że implantowana przez 3,3 roku płytka kostna i śruby z PLLA uległy degradacji na fragmenty i rozpadły się na cząstki, które w TEM mają strukturę igiełkową. Ultrastrukturalna analiza TEM materiału PLLA o okresie implantacji 5,7 lat wykazuje porównywalną morfologię. Analiza SEM sugerowałaby, że średni rozmiar cząstek materiału implantowanego przez 5,7 roku jest znacznie mniejszy. Pomiędzy 3,3 a 5,7 rokiem materiał PLLA ulega degradacji z fragmentów do cząstek, które w TEM mają strukturę igiełkową. Obserwacje w mikroskopie świetlnym sugerują, że liczba cząstek PLLA, które były internalizowane przez komórki, wzrastała wraz z dłuższym okresem implantacji.
Masa cząsteczkowa, około 5000, jest identyczna dla obu okresów implantacji. Rozema21 opisał, że M¯n równa 5000 może być punktem krytycznym jako początek względnie wysokiego rozpadu. Jednakże cząsteczki PLLA mają dość wysoką krystaliczność21 , co prawdopodobnie jest jednym z czynników, które sprawiają, że są one bardzo stabilne i mało podatne na hydrolizę. Może to tłumaczyć bardzo ograniczoną progresję degradacji cząstek PLLA w okresie od 3,3 do 5,7 lat. Do 5,7 roku nie doszło do znacznej utraty masy lub całkowitej resorpcji. Jeśli cząstka PLLA ulega degradacji, to prawdopodobnie w postaci niewykrywalnych oligomerów, które są wypłukiwane z płynami tkankowymi i nie są wykrywane w analizie materiału. Ten mechanizm może tłumaczyć te same wartości masy cząsteczkowej i krystaliczności dla obu okresów implantacji.
Pochodzenie opisywanego pęcznienia nie jest do końca jasne. Być może obrzęk jest inicjowany przez stopniowy rozpad płytki kostnej PLLA i śrub na fragmenty. Bergsma i wsp.18 opisali, jak podczas degradacji płytki i śruby PLLA rozpadają się na małe fragmenty, co może prowadzić do zwiększenia objętości w porównaniu z objętością nienaruszonej płytki kostnej i śrub. W przekroju poprzecznym tkanki wszczepionej na 3 lata, powierzchnię zajętą przez a-komórkowe cząsteczki PLLA oszacowano na 65% całkowitej powierzchni. Pozostałe 35% przekroju zajęte było przez otaczającą kapsułkę włóknistą. Böstman i wsp.22 w badaniu z użyciem śródszpikowo umieszczonych śrub i pinów z poliglikolidu sugerują, że zwiększone osmotyczne ciśnienie śródszpikowe związane z degradacją poliglikolidu i oporem otaczającej tkanki może decydować o powstaniu zatoki. Pochodzenie opisywanego obrzęku można ewentualnie wyjaśnić kombinacją czynników, takich jak rozpad materiału PLLA na małe cząstki i zwiększone ciśnienie osmotyczne wywołane przez te fragmenty oraz, w porównaniu z kością, niską oporność tkanki podskórnej.
Inny mechanizm, który może wywoływać lub utrzymywać obrzęk, podają Fornasier i wsp.23, którzy opisali korelację pomiędzy obecnością dwójłomnych cząstek polietylenu, gęstością histiocytów i grubością błony fibrohistiocytarnej, z których wszystkie wykazywały wzrost wraz z upływem czasu. Przekrój uzyskany z materiału o okresie implantacji 5,7 roku składa się z cienkiej włóknistej kapsułki i arkuszy kolagenu przeplatanych różnymi komórkami. W przeciwieństwie do materiału, który był implantowany przez 3,3 roku, w przestrzeni pozakomórkowej nie można znaleźć prawie żadnego materiału PLLA. Większość kryształów PLLA została zinternalizowana przez komórki fagocytujące w wakuolach związanych z błoną komórkową. Wyniki te mogą prowadzić do wniosku, że przy dłuższym okresie implantacji dochodzi do stopniowego przemieszczania się cząstek PLLA z przestrzeni zewnątrz- do wewnątrzkomórkowej w komórkach fagocytujących, które są osadzone w macierzy włóknistej. Obecność makrofagów i fibrocytów w odpowiedzi na cząstki PLLA może być oczekiwana, ponieważ makrofagi są znane z fagocytowania i usuwania materiału z ciała obcego. W odpowiedzi na internalizację materiału ciała obcego makrofagi mogą aktywować i przyciągać komórki podobne do fibroblastów.
Zewnątrzkomórkowa degradacja cząstek PLLA jest prawdopodobnie procesem hydrolitycznym. Jednakże komórki fagocytujące, a zwłaszcza makrofagi, mogą uwalniać szereg lizosomalnych enzymów hydrolitycznych, które mogą wpływać na degradację. Jeśli tak jest, to należałoby się spodziewać zwiększonego stężenia enzymu przewodniego lizosomów, fosfatazy kwaśnej. Fosfataza kwaśna jest obecna we wszystkich lizosomach, a jej łatwa identyfikacja czyni z niej doskonały marker. W tkance z okresem implantacji 5,7 roku wykazano obecność fosfatazy kwaśnej, choć nie w dużej ilości.
Innym enzymem, który był badany jest dehydrogenaza mlekowa (LDH). LDH przekształca kwas mlekowy w pirogronian, który może być metabolizowany w cyklu kwasu cytrynowego. Jeśli znaczna ilość wewnątrzkomórkowych cząstek PLLA ulegnie degradacji do kwasu mlekowego, można oczekiwać wzrostu jego stężenia. Ponownie, wykazano obecność osadów związanych z enzymami, ale nie w dużych ilościach. Chociaż zbadano bardzo ograniczoną liczbę enzymów, wyniki te mogą prowadzić do wniosku, że cząstki PLLA są ostatecznie wszystkie internalizowane przez komórki fagocytujące, które nie mogą aktywnie degradować cząstek PLLA. Hydroliza jest prawdopodobnie jedynym mechanizmem degradacji, a wysoce krystaliczne cząstki ulegają degradacji bardzo powoli. Sugeruje to, że istnieje długotrwała obecność wewnątrzkomórkowych cząstek PLLA lub że cząstki są wydalane do przestrzeni zewnątrzkomórkowej, ponieważ komórka nie może ich aktywnie degradować. Niestrawne cząstki ciała obcego mogą powodować ciągłe przyciąganie makrofagów, które mogą ponownie fagocytować cząstki PLLA i w ten sposób powtarzać cykl wewnątrzkomórkowy.
W oparciu o literaturę dotyczącą implantów silikonowych inną możliwością może być migracja cząstek PLLA lub makrofagów z cząstkami PLLA do tkanki węzłowej z miejsca wszczepienia implantu24. W tym badaniu nie wycięto węzłów chłonnych, ale być może w przyszłych badaniach należałoby zbadać możliwość migracji cząstek PLLA do węzłów chłonnych.
W literaturze ortopedycznej opublikowano wiele prac dotyczących aseptycznego obluzowania stawów protetycznych z powodu obecności cząstek polimeru znajdujących się w tkance włóknistej, makrofagów i komórek ciała obcego. Horowitz i wsp.25 opisali w badaniach in vitro, że ekspozycja na cząstki polimetakrylanu metylu (PMMA) hamuje syntezę DNA makrofagów, upośledza ich zdolności cytotoksyczne i ostatecznie powoduje śmierć komórek. W naszych badaniach komórki, które internalizowały lamelarne lub igiełkowate cząstki PLLA wykazywały oznaki łagodnego uszkodzenia komórek, takie jak powiększone mitochondria i akumulacja glikogenu. Ludzkie fibroblasty w hodowli gromadzą glikogen w swojej cytoplazmie w miarę zbliżania się do okresu starzenia. W próbkach 5,7-letnich nie zaobserwowano żadnych oznak uszkodzenia komórek. Gdy wszczepiony materiał powoduje uszkodzenie komórek, można spodziewać się wzrostu wycieku wewnątrzkomórkowej dehydrogenazy mleczanowej. Szkodliwe działanie cząstek PLLA wydaje się być bardzo małe, nie wykazano zwiększonej ilości mitochondrialnego LDH, można więc przypuszczać, że zinternalizowane kryształy PLLA nie powodują poważnego uszkodzenia komórek lub ich śmierci. Cząsteczki PLLA prawdopodobnie wywołają odpowiedź makrofagów i fibrocytów. Czas potrzebny do całkowitej degradacji hydrolitycznej kryształów PLLA będzie prawdopodobnie determinował czas trwania obrzęku.
Wyniki badań kości trepanowanej od pacjenta z okresem implantacji 5,7 roku, wykazują szereg różnic w porównaniu z wynikami badań materiału implantowanego podskórnie. Degradacja gwintu śruby PLLA przypomina degradację płytki kostnej PLLA, jednak pozostałości śruby nie są poprzeplatane włóknami kolagenowymi, a internalizacja cząstek PLLA przez komórki fagocytarne jest bardzo ograniczona. Wyniki te mogą wskazywać na zróżnicowanie mechanizmu degradacji pomiędzy podskórnymi i śródkostnymi implantami PLLA oraz odczynu histologicznego, jaki wywołuje implant. Różnice te można tłumaczyć faktem, że być może kość korowa jest w stanie wytrzymać ciśnienie osmotyczne materiału ulegającego degradacji i w ten sposób zapobiec pęcznieniu materiału PLLA. Materiał PLLA pozostaje gęsto upakowany, co być może zapobiega wrastaniu komórek i internalizacji cząstek PLLA.
Podsumowując, rozpad PLLA na cząstki z towarzyszącym mu wzrostem objętości samego materiału PLLA i tkanki włóknistej, może wyjaśniać pochodzenie opisywanego obrzęku. Cząstki PLLA o bardzo wolnym tempie degradacji hydrolitycznej, choć nie są bardzo drażniące dla komórki, wywołują jednak reakcję komórkową. Są to procesy, które przypominają te obserwowane w aseptycznym rozluźnieniu kości w zastosowaniach ortopedycznych. Biokompatybilność niedegradowanego materiału PLLA została potwierdzona w wielu badaniach. Zdegradowane cząstki PLLA nie powodują poważnych uszkodzeń komórek, ale mogą wywoływać i utrzymywać klinicznie wykrywalny obrzęk, co może sugerować, że te cząstki PLLA nie mogą być dłużej uważane za w pełni biokompatybilne. Przyszłe badania muszą skupić się na biodegradowalnych polimerach, które nie rozpadają się na wysoce krystaliczne cząstki, aby uniknąć bardzo długich okresów degradacji, a w niektórych zastosowaniach klinicznie wykrywalnego obrzęku.