Materiał roślinny, warunki hodowli i zabiegi na korzeniach
Sadzonki Medicago truncatula-R108, użyte do badań, zostały zebrane w 2008 roku w INRA-Montpellier, Francja, i przechowywane w temperaturze -20°C w probówce, w której pusta przestrzeń była wypełniona hydrofilową bawełną w celu zmniejszenia wilgotności. Nasiona lekko spulchniano papierem ściernym (ziarnistość P80), a następnie sterylizowano powierzchniowo przez 30 min. pod mieszadłem w roztworze przygotowanym z 1/4 tabletki komercyjnego wybielacza w 250 mL wody z dodatkiem 30 µL detergentu. Następnie nasiona były trzykrotnie dokładnie płukane w sterylnej wodzie w warunkach przepływu laminarnego. Jeśli detergent był nadal obecny, wykonywano dodatkowe etapy płukania. Po ostatnim płukaniu nasiona przetrzymywano przez 1 h w wodzie w temperaturze pokojowej w celu imbibicji. Usunięto nadmiar wody i nasiona rozrzucono losowo na podłoże wodne 1% agar (HP 696-Kalys). Płytki umieszczano do góry dnem w temperaturze 4°C w ciemności na 3 do 4 dni stratyfikacji. Ostatecznie kiełkowanie przeprowadzono w temperaturze pokojowej w ciemności przez noc, trzymając płytki do góry nogami, aby umożliwić prosty wzrost korzeni poza agarem i ułatwić dalsze przenoszenie na nowe podłoże hodowlane. Sadzonki hodowano następnie na zmodyfikowanej pożywce Fahraeusa zestalonej 1,3% agarem (HP 696-Kalys) (zmodyfikowana pożywka Fahraeusa: CaCl2 1 mM, MgSO4 0,5 mM, KH2PO4 0,7 mM, Na2HPO4 0,8 mM, Fe EDTA 50 μM, 0,1 mg/L każdego z następujących mikroelementów: MnSO4, CuSO4, ZnSO4, H3BO3 et Na2MoO4, pH dostosowane do 7,5 za pomocą KOH) . Na kwadratową szalkę Petriego (12 cm × 12 cm) zawierającą podłoże hodowlane, przykrytą obojętnym papierem chłonnym (Mega International-USA), przenoszono maksymalnie 8 siewek z korzeniami o długości około 1 cm, aby uniknąć penetracji korzeni. Podczas przenoszenia, do każdego korzenia dodawano 125 µL sterylnej wody Milli-Q, aby zapobiec wysuszeniu przed zamknięciem pudełek taśmą Millipore. Czarne kieszenie zostały użyte do przykrycia dolnej części naczynia w celu ochrony korzeni przed światłem. Na koniec, naczynia ustawiono pod kątem około 45° od pionu w pomieszczeniach hodowlanych utrzymujących warunki 24 °C, 60% wilgotności i 16 h oświetlenia.
Aby przetestować algorytm RHS, korzenie poddano różnym zabiegom. Pierwszy zestaw nietraktowanych roślin był uprawiany przez 3 dni po przeniesieniu, przed obrazowaniem korzeni pod mikroskopem. Dla warunków traktowania, 2 dni po przeniesieniu, otwierano szalki i umieszczano je poziomo, aby dodać 20 mL roztworu zawierającego albo 10 nM czynnika Nod (NF), albo 10 µM kwasu indolilo-3-octowego (IAA) rozcieńczonego w sterylnej wodzie Milli-Q. Jako kontrolę, rośliny traktowano sterylną wodą Milli-Q. Po 1 h zanurzenia korzeni, nadmiar cieczy usuwano, a naczynia zamykano i umieszczano ponownie w pomieszczeniu hodowlanym na 18 h.
Nasiona Arabidopsis thaliana (Col0) sterylizowano powierzchniowo przez 3 h gazowym chlorem wytworzonym przez zmieszanie 3 mL HCl 37% z 50 mL podchlorynu sodu 10%. Nasiona umieszczano w kwadratowym naczyniu (12 cm × 12 cm) wypełnionym pożywką 1/2MS galaretowaną z użyciem 0,8% agaru roślinnego (Duchefa). Naczynie przechowywano przez 2 dni w ciemności w temperaturze 4°C w celu stratyfikacji, a następnie w temperaturze 21°C, przy oświetleniu 16 h w celu kiełkowania i hodowli. Po 9 dniach siewki wykorzystywano do akwizycji obrazu.
Nasiona Brachypodium distachyon (Bd21-3) odrywano od łuski za pomocą kleszczy, następnie sterylizowano przez 15 min na bujaku w 1 mL buforu sterylizującego (20% wybielacza domowego, 0,1% Tween20) i płukano 4-krotnie w podwójnie destylowanej wodzie. Nasiona umieszczano w kwadratowym naczyniu (12 cm × 12 cm) wypełnionym 1/2MS uzupełnionym 1% agarem, tak aby biegun zarodkowy osi długiej nasiona skierowany był ku dołowi. Po 2 dniach stratyfikacji w temperaturze 4 °C, szalki przenoszono i umieszczano pionowo w komorze wzrostowej w temperaturze 28 °C i 16-godzinnym oświetleniu w celu kiełkowania. Sadzonki były gotowe do obrazowania 3 dni po wykiełkowaniu.
Akwizycja obrazów
Przed szczegółowym opisem różnych etapów metody, cały potok obrazujący cały proces obejmujący obrazowanie, analizę skryptu Fiji, sortowanie danych i dopasowanie sigmoidalne jest podsumowany w pliku dodatkowym 2: Figure S6.
Trzy dni po przeniesieniu do komory wzrostowej (to znaczy 18 h po określonych zabiegach, jeśli dotyczy), korzenie zostały wycięte z organów powietrznych i umieszczone między szkiełkiem a szkiełkiem nakrywkowym w płynnej pożywce Fahareus. Mikroskop jasnego pola (Leica DMI6000 ze zmotoryzowanym stolikiem x, y, z. Oprogramowanie LAS, lampa halogenowa Leica, obiektyw 5× Dry z aperturą numeryczną 0.15, kamera Hamamatsu Orca ER-1395) został użyty do akwizycji obrazów o rozdzielczości 19,703 ppi. Szerokość RH jest pokrywana średnio przez 10 pikseli. Do akwizycji i rekonstrukcji wszystkich analizowanych obrazów użyto zmotoryzowanego stolika mikroskopu oraz możliwości rekonstrukcji mozaikowej oprogramowania LAS (analogiczne narzędzia są swobodnie dostępne w programach ImageJ i Fiji ). Dokładny wybór końca strefy korzeniowej do akwizycji nie jest wymagany, ponieważ wybór ten będzie później standaryzowany za pomocą modelu sigmoidalnego. Aby uzyskać ostre obrazy RHs wzdłuż korzenia, wykonano Z-stacks z pięciu obrazów oddalonych od siebie o 100 µm.
Obrazy jasnego pola korzeni Arabidopsis uzyskano z rozdzielczością 15,631 ppi umieszczając otwartą skrzynkę hodowlaną bezpośrednio pod stereoskopem Nikon SMZ18, wyposażonym w obiektyw 0,5× Nikon SHR Plan Apo WD:71, zoom 8 i kamerę Hamamatsu C11440. Trzy pozycje XY zostały pozyskane dla każdego korzenia poprzez ręczne przesunięcie pudełka pod polem widzenia tak, aby dwa kolejne obrazy nałożyły się na siebie. Z-stack nie był konieczny.
Sadzonki Brachypodium były obrazowane pomiędzy szkiełkami mikroskopowymi a szkiełkami nakrywkowymi wypełnionymi wodą, utrzymując liście nieosłonięte od szkiełka nakrywkowego. Obrazy były pozyskiwane przy użyciu tego samego systemu optycznego, co dla siewek Arabidopsis, z ostatecznym powiększeniem 40×. Dla każdego korzenia uzyskano dwie pozycje XY, aby dwa kolejne obrazy nałożyły się na siebie. Z-stack nie był konieczny.
Obrazy XY uzyskane dla Arabidopsis i Brachypodium zostały zszyte w Fiji przy użyciu pluginu 2D Stitching . Jeśli nakładanie się obrazów nie było wystarczające do prawidłowego działania 2D Stitching, zszywanie było wykonywane ręcznie przy użyciu wtyczki MosaicJ.
Root Hair Sizer: przetwarzanie obrazów
Wszystkie procesy przetwarzania obrazów zostały wykonane przy użyciu otwartego oprogramowania Fiji, ale mogą być również wykonane w otwartym oprogramowaniu ImageJ z zainstalowanymi wtyczkami AnalyzeSkeleton i Auto_Threshold. Jako punkt wyjścia wymagany jest pojedynczy obraz, na którym wszystkie RH są skupione. Tutaj wygenerowaliśmy projekcje Z poprzez zsumowanie pięciu pozyskanych plasterków, ale można zastosować dowolną metodę akwizycji i przetwarzania dającą pojedynczy ostry obraz RH wzdłuż korzenia.
Reszta przetwarzania może być zastosowana poprzez uruchomienie algorytmu RHS dostępnego w pliku dodatkowym 1: Script 1. Podsumowanie wszystkich kroków algorytmu jest również dostępne w Tabeli 1 i zilustrowane na Rys. 2 oraz w pliku dodatkowym 2: Rys. S5. Plik dodatkowy 5: Movie 1 jest dodatkowo dostępny w celu wyjaśnienia zrozumienia interfejsu. Pierwsza część przetwarzania RHS polega na detekcji obszaru RHs. Metoda, zainspirowana przez Inoue et al. , polega na progowaniu intensywności pikseli. Pierwszy proces wykrywa kontur RHs, podczas gdy drugi przetwarza tylko kontur korzenia. Aby uniknąć ręcznego definiowania progu intensywności pikseli, zastosowano automatyczne progowanie. Detekcja korzenia wraz z RHs została osiągnięta metodą Bernsena, podczas gdy sama oś korzenia została wykryta metodą Phansalkara (plik dodatkowy 2: Rys. S7 i Tabela 1 – kroki 3 i 4). W celu wygładzenia i wypełnienia dziur w obu wygenerowanych obrazach binarnych zastosowano kilkustopniową dylatację i erozję pikseli (Tabela 1-kroki 3.2 i 4.2). Obraz osi korzenia został następnie odjęty od obrazu całego korzenia (korzeń z RHs) (plik dodatkowy 2: Fig. S7 i tab. 1-krok 5), aby uzyskać powierzchnię pokrytą tylko przez RHs. Szum tła został usunięty w kroku 5.2 (Tabela 1-krok 5.2).
Jako że kolejne kroki wymagają, aby korzeń był prosty, linia średnia korzenia (RML) jest odzyskiwana jako najdłuższa ścieżka szkieletu uzyskanego z obrazu osi korzenia po wykonaniu poleceń 'Skeletonize' i 'Analyse Skeleton (2D/3D)' (Dodatkowy plik 2: Rys. S7 i Tabela 1-krok 8.1 i 8.2). Obraz RML jest następnie przekształcany w selekcję poliliniową (kroki 8.3 i 8.4), a następnie prostowany poleceniem Fiji 'Straighten' (plik dodatkowy 2: Rys. S7 i Tabela 1-krok 10). Ponieważ polecenie 'Straighten' generuje obraz w poziomach szarości, przeprowadzana jest dodatkowa binaryzacja (Tabela 1-kroki 11 i 12). W końcowym obrazie piksele RH mają wartość 1, a piksele tła wartość 0.
Root Hair Sizer: Pomiar długości włosów RH
Pomiar długości włosów RH jest wykonywany w dwóch krokach, jak szczegółowo opisano w sekcji „Wyniki” (Rys. 2). Po pierwsze, prostokątny wybór jest przesuwany wzdłuż osi korzenia wyprostowanego, zbinaryzowanego obrazu RHs, mierząc wysokość „L” powierzchni RH w obrębie wyboru w każdym kroku (Tabela 1-kroki 14.1 do 14.3) ze wzorem (1). Po drugie, określona liczba (typowo 10) kolejnych indywidualnych wartości L była filtrowana metodą Max, aby uzyskać wartość Lmax jako oszacowanie długości RH (Tabela 1-kroki 14.4 do 14.5). Każda wartość Lmax jest powiązana z odpowiednią odległością od wierzchołka korzenia i zapisana w tabeli.
Root Hair Sizer: regulowane ustawienia
W zależności od typu korzenia i właściwości uzyskanego obrazu, może być konieczne dostosowanie niektórych ustawień. Ustawienia te są zaznaczone gwiazdkami w skrypcie RHS, natomiast ustawienia zastosowane przez nas w przykładach z Medicago są wymienione w Tabeli 1. Podczas progowania obrazu, wartość promienia dla metod progowania Bernsena i Phansalkara może być dostosowana np. do obrazów o różnej rozdzielczości, podobnie jak liczba nadżerek i dylatacji zastosowanych bezpośrednio po progowaniu. Jeśli profil włośników korzenia i rodzaj układu optycznego użytego do akwizycji bardzo różni się od przedstawionego tutaj przykładu, użytkownicy są zachęcani do personalizacji strategii progowania w celu dostosowania do własnych ustawień. Na przykład dla korzeni Arabidopsis, metoda progowania Phansalkar zamiast Bernsen została użyta w kroku 3 do wykrycia kształtu RH, podczas gdy metoda progowania Bernsen zamiast Phansalkar została użyta w kroku 4 do wykrycia kształtu korzenia. Dodatkowo, krok 5 nie był już konieczny (plik dodatkowy 4: Skrypt 4). Proces szkieletyzacji korzeni również może wymagać pewnych korekt. Stopień uproszczenia polilinii uwypuklającej linię średnią korzenia uzyskany po poleceniach „Skeletonize” i „Analyse Skeleton (2D/3D)” można dostosować do znacznie większych lub mniejszych obrazów. Na koniec, w procesie prostowania, ważne jest dostosowanie szerokości polilinii tak, aby obejmowała wszystkie RH.
Podczas uruchamiania RHS, okno dialogowe pozwala użytkownikowi na wybranie segmentu korzenia do analizy. Szerokość w zaznaczenia skanowania może być dostosowana tak, aby było ono nieco cieńsze niż jedno RH (od 1/2 do 2/3). Wreszcie, można również dostosować wielkość przedziału, w którym należy wybrać Lmax. W przedstawionych przykładach interwał 10 selekcji do zbierania Lmax wydawał się być dokładny. Efekt zmiany tego parametru, który reguluje ilość zachowanych punktów danych w stosunku do zmienności danych spowodowanej np. „dziurami” w profilu RH, jest zilustrowany w pliku dodatkowym 2: Fig. S8).
Root Hair Sizer proponuje również dodawanie adnotacji do obrazu, jeśli niektóre części korzenia muszą być usunięte z analizy. Położenie tych komentarzy wzdłuż korzenia jest odzyskiwane w końcowej tabeli poprzez adnotację każdego punktu danych jako 1 i 0 (odpowiednio obecność i brak komentarza w tym punkcie) na oddzielnych kolumnach. Ponadto, na kilku etapach RHS pozwala użytkownikowi na sprawdzenie i ewentualne ręczne skorygowanie automatycznego procesu osiągniętego przez algorytm. Wszystkie automatyczne definicje i ręczne korekty są rejestrowane i zapisywane jako region zainteresowania (ROI). Po pierwszym uruchomieniu RHS możliwe jest przeanalizowanie innego regionu korzenia z wykorzystaniem ROI związanego z oryginalnym obrazem poprzez zastosowanie skryptu przedstawionego w pliku dodatkowym 6: Script 2. Aby uruchomić ten skrypt, ważne jest użycie tej samej szerokości RML oraz wypełnienie pierwszego okna dialogowego tymi samymi nazwami komentarzy, które są używane w głównym algorytmie RHS.
Obróbka danych
Dane zebrane za pomocą RHS są sortowane za pomocą arkusza kalkulacyjnego Excel. Dla wszystkich prezentowanych wyników z analizy usunięto regiony wykazujące artefakt (np. pęcherzyk powietrza lub pył). Dla niektórych obrazów, jedna strona korzenia prezentowała mniejsze RH na całej długości w porównaniu do drugiej strony, głównie dla korzeni rosnących obok siebie. W takich przypadkach, tylko strona z wyższą wilgotnością względną była zachowywana do analizy. Inne specyficzne rodzaje danych lub parametry są wymienione w legendach rysunków lub w tekście. Jak opisano powyżej w części „Wyniki”, w celu dokładnego dopasowania punktów danych wykonano dwa kolejne dopasowania sigmoidalne. Następnie, jak pokazano na rysunkach Fig. 3b, plik dodatkowy 2: Figs. S3, S4, uzyskaliśmy dobre oszacowanie odcinka krzywej o kształcie sigmoidalnym.
Dane zostały dopasowane krzywą sigmoidalną
To pierwsze dopasowanie zapewnia punkt przegięcia d50_1 i długość przedłużenia δ_1. Następnie ustalamy granice dla drugiego dopasowania pomiędzy d50_1 ± 5δ_1.
Sigmoidalne dopasowanie zostało osiągnięte przy użyciu oprogramowania GraphPad Prism. Dane uzyskane z każdego obrazu były traktowane oddzielnie. Zastosowano dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów, wykorzystując następujące reguły do określenia wartości początkowych dopasowania dla każdego rozpatrywanego obrazu:
z Labsolute min i Labsolute max odpowiednio minimalną i maksymalną długością RH zmierzoną we wszystkich danych uzyskanych wzdłuż całego korzenia rozważanego obrazu.
Pomiar szybkości wzrostu korzeni
Pomiar ten wykonano na oddzielnych partiach korzeni w tych samych warunkach, co w przypadku pomiaru długości RH. Po 1 h zanurzenia korzeni w roztworze traktującym, pudełka były opróżniane, następnie zamykane, a pozycja RT była zaznaczana na wieczku pudełka markerem. Po 18 h inkubacji zaznaczano nową pozycję RT i skanowano pudełko. Odległość pomiędzy dwoma kolejnymi punktami była mierzona przy użyciu oprogramowania Fiji. Szybkość wzrostu korzeni może być mierzona jako stosunek tej odległości przez czas pomiędzy dwoma pomiarami. Wzrost korzeni zmierzono z dwóch powtórzeń biologicznych, uzyskując następujące wartości (średnia ± SE): nietraktowane: 296 ± 17 µm/h (n = 26); H2O: 304 ± 16 µm/h (n = 26); NF: 225 ± 15 µm/h (n = 23); IAA: 55 ± 3 µm/h (n = 19).
Statystyki
Do analizy statystycznej i dopasowania sigmoidalnego wykorzystano oprogramowanie GraphPad Prism. Wszystkie szczegóły dotyczące wielkości próby, powtórzeń biologicznych lub testów wiodących są podane w legendach rycin.