Spektroskopia ultrafioletowo-widoczna, lub UV-Vis, jest jedną z najbardziej popularnych technik analitycznych w laboratorium.
W spektroskopii UV-Vis, światło jest przepuszczane przez próbkę o określonej długości fali w spektrum UV lub widzialnym. Jeśli próbka absorbuje część światła, nie całe światło zostanie przepuszczone, czyli transmitowane. Transmisja jest stosunkiem intensywności światła przepuszczonego do światła padającego i jest skorelowana z absorbancją. Absorbancja może być wykorzystana w sposób ilościowy, do uzyskania stężenia próbki. Może być również użyta w sposób jakościowy, do identyfikacji związku poprzez dopasowanie zmierzonej absorbancji w zakresie długości fal, zwanym widmem absorbancji, do opublikowanych danych. Ten film przedstawi spektroskopię UV-Vis i zademonstruje jej zastosowanie w laboratorium do określania stężenia próbki i kinetyki reakcji.
Gdy foton uderza w cząsteczkę i zostaje zaabsorbowany, cząsteczka przechodzi ze stanu podstawowego w stan o wyższej energii. Różnica energii pomiędzy tymi dwoma stanami to przerwa między pasmami. Energia fotonu musi dokładnie odpowiadać przerwie pasmowej, aby foton mógł zostać zaabsorbowany. Struktura chemiczna określa przerwę między pasmami, dlatego każda cząsteczka ma unikalne widmo absorpcji.
Absorbcja jest zgodna z prawem Beera, które mówi, że absorbancja równa się molowemu współczynnikowi tłumienia razy długość drogi i stężenie. Molowy współczynnik tłumienia jest związany z indywidualną zdolnością związku do pochłaniania światła o określonej długości fali. Długość drogi odnosi się do odległości przebytej przez światło w próbce, która w standardowych kuwetach wynosi zazwyczaj 1 cm. Prawo Beera może być użyte do obliczenia stężenia próbki, jeśli znana jest jej chłonność, lub można użyć krzywej kalibracyjnej.
UV-Vis jest często nazywana techniką ogólną, ponieważ większość cząsteczek absorbuje światło w zakresie długości fal UV-visible. Zakres UV rozciąga się od 100-400 nm, a spektrum widzialne od 400-700 nm. Jednakże większość spektrofotometrów nie działa w głębokim zakresie UV 100-200 nm, ponieważ źródła światła w tym zakresie są drogie. Większość spektrofotometrów UV-Vis wykorzystuje lampę deuterową dla zakresu UV, która wytwarza światło z zakresu 170-375 nm, oraz lampę z żarnikiem wolframowym dla zakresu widzialnego, która wytwarza światło z zakresu 350-2,500 nm.
Ponieważ źródłem światła jest zazwyczaj lampa o szerokim zakresie długości fal, specyficzna długość fali absorbancji jest wybierana za pomocą filtrów lub monochromatora. Monochromator to urządzenie, które rozdziela fale świetlne przestrzennie, a następnie umieszcza szczelinę wyjściową w miejscu, gdzie znajduje się pożądana długość fali świetlnej. Monochromator może być skanowany w zakresie długości fali, aby uzyskać całe widmo absorbancji. To sprawia, że technika ta jest przydatna do ilościowego określania i identyfikowania szerokiego zakresu cząsteczek.
Gdy podstawy spektroskopii UV-Vis zostały już przedstawione, przyjrzyjmy się prostemu eksperymentowi UV-Vis w laboratorium.
Przed rozpoczęciem pomiaru włącz spektrofotometr i pozwól lampom rozgrzać się przez odpowiedni okres czasu, aby je ustabilizować.
Przygotuj ślepą próbę, napełniając czystą kuwetę rozpuszczalnikiem do próbek, a następnie wytrzyj jej zewnętrzną część papierem niestrzępiącym się, aby usunąć wszelkie odciski palców.
Upewnij się, że kuweta jest prawidłowo ustawiona, a jej rowkowane boki znajdują się poza ścieżką wiązki, a następnie włóż ją do spektrofotometru. Zabezpieczyć pokrywę, aby zapobiec przedostawaniu się światła z otoczenia do systemu.
Pomiar absorbancji ślepej próby przy jednej długości fali lub w zakresie długości fali. Zapisać absorbancję, ponieważ musi ona zostać odjęta od absorbancji próbki.
Następnie wyrzucić próbę ślepą i dwukrotnie przepłukać kuwetę próbką. Następnie napełnić kuwetę w około ¾ do pełna próbką. Ponownie wytrzeć zewnętrzną stronę kuwety, aby upewnić się, że jest ona czysta i wolna od odcisków palców.
Włożyć kuwetę do spektrofotometru w prawidłowej orientacji i zabezpieczyć pokrywę.
Pobierać pomiar absorbancji lub widmo przy tej samej długości fali lub zakresie długości fal co próba ślepa. Odjąć widmo lub pomiar ślepej próby, jeżeli urządzenie nie robi tego automatycznie.
Z zebranego widma absorbancji wyznaczyć maksimum absorbancji, czyli λmax.
Aby określić ilościowo ilość analitu w próbce, należy utworzyć krzywą kalibracyjną z wykorzystaniem zakresu znanych stężeń analitu. Aby uzyskać więcej informacji na temat konstruowania i stosowania krzywej kalibracyjnej, należy obejrzeć film z tej kolekcji „Krzywe kalibracyjne”.
Pomiar absorbancji może być również wykorzystany do obliczenia kinetyki reakcji poprzez pomiar wzrostu lub spadku stężenia związku w trakcie reakcji. Rozpocznij od wykonania wstępnego odczytu próbki, w tym przypadku niebieskiego barwnika, przy maksimum absorbancji przed reakcją.
Następnie szybko dodaj odczynnik, w tym przypadku wybielacz, aby rozpocząć reakcję chemiczną. Dobrze wymieszać, tak aby wymieszał się z próbką.
Pomierzyć absorbancję w maksimum absorbancji w czasie.
Początkowe widmo absorbancji próbki niebieskiego barwnika jest pokazane. Kolory tła przedstawiają kolory światła w spektrum widzialnym. Niebieski barwnik ma maksimum absorbancji przy około 630 nm.
Zmierzono kinetykę reakcji między niebieskim barwnikiem a wybielaczem w czasie. Absorbancja niebieskiego barwnika maleje w czasie, ponieważ reaguje on z wybielaczem. Absorbancja osiąga wartość bliską zeru po 300 s, co oznacza, że reakcja jest bliska zakończenia. Aby uzyskać więcej informacji na temat kinetyki i reakcji, obejrzyj film JoVE Science Education „Reaction Rate Laws”.
Spektroskopia UV-Vis jest często stosowana w wielu różnych dziedzinach badań, aby zidentyfikować lub określić ilość próbki.
Na przykład, spektroskopia UV-Vis jest często stosowana w dziedzinach biologicznych, aby określić ilość białka w próbce. Test Bradforda jest często używany do ilościowego oznaczania białek, z pomocą barwnika. Najpierw przygotowywana jest krzywa kalibracyjna o znanym stężeniu białka, zazwyczaj przy użyciu albuminy surowicy bydlęcej lub BSA. Następnie do każdego z wzorców i do próbki dodawany jest niebieski barwnik Coomassie. Absorbancja kompleksu białko – barwnik jest następnie mierzona przy 595 nm.
Alternatywnie, białka mogą być mierzone bezpośrednio przez ich absorbancję przy 280 nm. W tym przykładzie stężenie białka jest określane ilościowo przy użyciu spektrofotometru o bardzo małej objętości. Dla wielu białek absorbancja 1 koreluje ze stężeniem 1 mg/mL.
Spektroskopia UV-Vis jest również stosowana do ilościowego określenia ilości komórek bakteryjnych w hodowli komórkowej. W przypadku tego pomiaru, absorbancję lub gęstość optyczną mierzy się przy długości fali 600 nm. Typowo, pomiar OD600 równy 1 wskazuje na obecność 8 x 108 komórek bakteryjnych na mL. Pomiar gęstości komórek podczas wzrostu kultury umożliwia określenie krzywej wzrostu bakterii i może pomóc w określeniu, kiedy kultura jest w fazie wzrostu wykładniczego.
Tlenek i dwutlenek azotu, lub NOx, jest produktem ubocznym spalin samochodowych i może być szkodliwy dla środowiska, ponieważ tworzy szkodliwy ozon troposferyczny. NOx może być mierzony poprzez reakcję z roztworem kwasu sulfanilowego i naptylo-etylenodiaminy. Powstały roztwór jest różowo zabarwioną cząsteczką barwnika azowego, którego intensywność jest bezpośrednio skorelowana ze stężeniem NOx. Stężenie to może być następnie określone za pomocą spektrofotometru UV-Vis.
Obejrzałeś właśnie wprowadzenie JoVE do spektroskopii UV-visible. Powinieneś teraz zrozumieć podstawy działania UV-Vis, jak mierzyć próbkę za pomocą UV-Vis i jak skorelować absorbancję ze stężeniem próbki.
Dziękuję za oglądanie!
Dziękuję za oglądanie!