Od czasu odkrycia przez Otto Warburga, że komórki nowotworowe wykazują niezwykle wysoki wskaźnik wychwytu glukozy i produkcji mleczanu1, wiele badań wykazało, że większość komórek nowotworowych polega na glikolitycznej produkcji energii2. Pobudziło to laboratoria na całym świecie do poszukiwania inhibitorów glikolizy jako potencjalnych leków przeciwnowotworowych.
Jednakże biologiczne znaczenie bardzo wysokiej ekspresji enzymów glikolitycznych w nowotworach jest enigmatyczne. Pierwszy enzym glikolizy – heksokinaza, ulega ekspresji na niższym poziomie w porównaniu z kolejnymi enzymami3, ma stosunkowo niską aktywność specyficzną i powinowactwo do substratów4,5. Jej całkowita aktywność ogranicza więc strumień przepływający przez glikolizę. Stąd nadmiar enzymów glikolitycznych w komórkach nowotworowych nie może promować szybszego katabolizmu glukozy, ale musi być związany z innymi, niekatalitycznymi procesami.
Egzymy glikolityczne należą do enzymów księżycowych6,7 , których fizjologiczna rola nie ogranicza się do funkcji katalitycznej i które mogą działać jako regulatory różnych procesów komórkowych. Przedstawiamy dowody na to, że enzym glikolityczny, aldolaza, może być silnym celem w terapii przeciwnowotworowej i że zakłócenie złożonej sieci wewnątrzkomórkowych interakcji, w których pośredniczy ten enzym, jest krytyczne dla jego działania przeciwnowotworowego.
Aldolaza znajduje się w połowie drogi szlaku glikolitycznego i katalizuje odwracalne rozszczepienie fruktozo-1,6-bisfosforanu (FBP) do dihydroksyacetonu-3-fosforanu i gliceraldehydu-3-fosforanu. Jej izoforma mięśniowa (ALDOA), która jest najliczniej występującą izoformą aldolazy w prawie wszystkich nowotworach8, może organizować filamenty aktynowe9,10, wpływać na aktywność AMPK11,12 i FBP213 oraz regulować sygnalizację Wnt14,15 i p5316. Wykazano również, że ALDOA jest zaangażowany w progresję fazy S/G1 cyklu komórkowego17. Ponieważ ALDOA uczestniczy w wielu zdarzeniach komórkowych niezbędnych dla przeżycia i proliferacji komórek nowotworowych, postawiliśmy hipotezę, że zaburzenie funkcji księżycowych ALDOA może stanowić preferowany cel terapii przeciwnowotworowej.
Nasze wyniki ujawniają, że w komórkach nowotworowych, ale nie w prawidłowych, zaburzenie interakcji ALDOA z cytoszkieletem aktyny prowokuje sekwencję zmian wewnątrzkomórkowych, w tym znaczne zwiększenie produkcji ROS, zaprzestanie syntezy ATP i wzrost poziomu wapnia, co skutkuje aktywacją kaspaz i blokadą proliferacji komórkowej. Ponieważ mechanizm tych zmian jest niezależny od katalitycznej funkcji ALDOA, wnioskujemy, że nadekspresja ALDOA w komórkach nowotworowych nie jest związana z ich wysokimi wymaganiami glikolitycznymi, ale stanowi adaptację, dzięki której przerzutowe komórki nowotworowe zapewniają integralność swojego cytoszkieletu aktynowego podczas przechodzenia transformacji epitelialno-mezenchymalnej. Tak więc, mechanizm działania przedstawiony tutaj może mieć znaczące implikacje dla rozwoju nowych, szeroko zakrojonych terapii przeciwnowotworowych.
UM0112176 – nowy inhibitor ALDOA – znacząco zmniejsza wzrost komórek nowotworowych
Aby zaburzyć interakcję ALDOA z jego partnerami wiążącymi, użyliśmy wolno wiążącego, mieszanego inhibitora ALDOA (UM0112176; Supplementary Fig. S1a), który znaleźliśmy poprzez wysokowydajne badania przesiewowe dużej biblioteki związków na Uniwersytecie w Montrealu. UM0112176 hamował aktywność ludzkiego ALDOA z IC50 ∼ 2-5 μM w sposób wolno wiążący (Supplementary Fig. S1b, c), bez hamowania innych enzymów glikolitycznych (Supplementary Fig. S1d). Sprawdziliśmy zdolność UM0112176 do hamowania aktywności ALDOA in vivo, oznaczając komórkowe poziomy fruktozo-1,6-bisfosforanu i fosforanów triozowych po 24-h inkubacji komórek w obecności inhibitora (Supplementary Fig. S1e). Wyniki wykazały znaczący wzrost miana substratu ALDOA i silny spadek produktów reakcji ALDOA zarówno w komórkach nowotworowych (KLN205, mysi rak płaskonabłonkowy płuc), jak i w komórkach prawidłowych (pierwotna hodowla astrocytów szczurzych). Jest to poparte obserwowanym odwrotnym trendem przy użyciu pożywek do hodowli komórkowych zawierających wyłącznie glutaminę.
Następnie wyznaczyliśmy krzywą dawka-odpowiedź UM0112176 i stwierdziliśmy, że 10 µM UM0112176 silnie zmniejszało wzrost wszystkich badanych nowotworowych linii komórkowych: KLN205, hNSCLC (ludzka linia komórkowa niedrobnokomórkowego raka płuca), BxPC3 (ludzki gruczolakorak trzustki) i AsPC1 (ludzki przerzut do wodobrzusza gruczolakoraka trzustki) (ryc. 1a). Tempo wzrostu prawidłowych linii komórkowych (astrocytów szczura, kardiomiocytów myszy-HL-1 i ludzkiej linii komórkowej nabłonkowej-ME16C) było praktycznie niezmienione przez 10 µM UM0112176 (Rys. 1a). Przedłużone 7-dniowe leczenie 10 µM UM0112176 zmniejszyło liczbę komórek nowotworowych czterokrotnie, podczas gdy liczba komórek prawidłowych zmniejszyła się tylko o 25-30% (ryc. 1b).
a Ilość komórek prawidłowych i nowotworowych obserwowana podczas inkubacji przez 48 h w obecności lub nieobecności 10 μM UM0112176 i normalizowana w odniesieniu do t = 0. Wartości są podane jako średnia i SD, *p < 0,05 dla wszystkich normalnych i nowotworowych linii komórkowych. b Ilość normalnych i nowotworowych komórek przeżywających po 7-dniowym traktowaniu 10 μM UM0112176. Wartości są podane jako średnia i SD, *p < 0,05. c Wpływ 10 μM UM0112176 (24 h leczenia) na ekspresję Ki67 w KLN205 i astrocytach. Ekspresja Ki67 w komórkach rosnących przy braku inhibitora została znormalizowana do 100%. Wartości podano jako średnią i SD, *p < 0,05. d Aktywacja kaspazy 3 w komórkach KLN205 po leczeniu UM0112176 (10 μM, 24 h). Pasek = 20 µm. Poniższy wykres przedstawia liczbę komórek wykazujących aktywną fluorescencję kaspazy 3. e Wpływ UM0112176 na morfologię cytoszkieletu aktynowego w nowotworowych liniach komórkowych, KLN205 i hNSCLC, oraz w komórkach prawidłowych, astrocytach i fibroblastach. Bar = 10 µm
Aby rozróżnić, czy zahamowanie tempa wzrostu komórek wynikało z podwyższonej śmiertelności, czy z zablokowania proliferacji, zbadaliśmy ekspresję komórkową Ki67 (marker proliferacji komórkowej) i aktywnej kaspazy (kaspaza 3, końcowy efektor apoptozy). Wyniki wykazały, że w komórkach nowotworowych, 10 µM UM0112176 (24 h leczenia) silnie zmniejszał sygnał fluorescencyjny związany z Ki67 (Rys. 1c) i zwiększał obecność aktywnej kaspazy (Rys. 1d). W komórkach prawidłowych nie obserwowano zmian (ryc. 1d) nawet po 48-godzinnym leczeniu (Supplementary Fig. S2a).
Traktowanie UM0112176 zaburza cytoszkielet aktyny i zmienia ROS, potencjał błony mitochondrialnej, poziom Ca2+, DSB i ATP w komórkach nowotworowych, ale nie normalnych
Aby wyjaśnić mechanizm działania UM0112176 zbadaliśmy szereg aktywności komórkowych, na które inhibitor może mieć potencjalny wpływ, w tym morfologię cytoszkieletu, stężenie ATP, poziom reaktywnych form tlenu (ROS), potencjał błony mitochondrialnej i pęknięcia podwójnej nici DNA (DSBs). Najbardziej wyrazistym przejawem działania inhibitora był całkowity zanik włókien naprężeniowych F-aktyny w komórkach nowotworowych, ale nie w prawidłowych, po 24 h inkubacji z inhibitorem (ryc. 1e). Co intrygujące, początek rozpadu polimerycznej aktyny był znacznie szybszy (<5 min) (Supplementary Fig. S3a) niż pełne zahamowanie ALDOA in vitro (∼15 min). Wspiera to hipotezę, że depolimeryzacja F-aktyny nie jest zależna od zahamowania aktywności ALDOA.
Wraz z zaburzeniem cytoszkieletu, obserwowaliśmy znaczne podwyższenie poziomu ROS i wapnia, spadek stężenia ATP i potencjału błonowego mitochondriów, jak również indukcję przerwania podwójnej nici DNA (Rys. 2a-e). Co ważne, zmiany indukowane przez UM0112176 w komórkach nowotworowych nie były przenoszone (np. poprzez uwalnianie ROS) na komórki prawidłowe: Leczenie UM0112176 komórek KLN205 współkulturowanych z normalnymi ludzkimi fibroblastami podnosiło poziom ROS tylko w komórkach nowotworowych (Supplementary Fig. S3b).
a Wpływ inkubacji UM0112176 (8 h) na poziom ROS w komórkach KLN205 i NSCLC oraz w astrocytach; obrazy (po prawej) pokazują sygnał fluorescencyjny związany z ROS w komórkach KLN205. Bar = 20 µm. b Wpływ inhibitora na stężenie Ca2+ w komórkach nowotworowych i prawidłowych. c Obniżenie poziomu ATP komórkowego po leczeniu UM112176 w komórkach nowotworowych i prawidłowych. Wartości podane są jako średnie z 3 pomiarów dla 3 niezależnych eksperymentów i SD, *p < 0,05. d Polaryzacja błony mitochondrialnej w komórkach nowotworowych i prawidłowych po traktowaniu UM0112176. Im bardziej żółte są mitochondria, tym większy jest stosunek agregatów JC-1 (czerwony, silna polaryzacja) do monomerów barwnika (zielony, zdepolaryzowany). Bar = 10 µM. e Indukcja DSB (zielony) przez traktowanie UM112176 (8 h) w komórkach KLN205 i hNSCLC. Jądra komórkowe wybarwiono DAPI (niebieski). Bar = 10 µm
Zmiany wywołane przez UM0112176 nie mogą być wyjaśnione przez hamowanie glikolizy
Aby dokładniej zbadać, czy zmiany wywołane przez UM0112176 mogą być odtworzone przez hamowanie glikolizy w komórkach nowotworowych, przetestowaliśmy wpływ innych efektorów enzymów glikolitycznych: czerwień alizarynową S, która hamuje mutazę fosfoglicerynianową (PGAM)18 oraz 3-PO ((2E)-3-(3-pirydynylo)-1-(4-pirydynylo)-2-propen-1-on), która pośrednio blokuje działanie 6-fosfofrukto-2-kinazy/fruktozo-bisfosfatazy-2 (PFK-2)19. Inhibicja PGAM powodowała wzrost ROS (Supplementary Fig. S4a) bez wpływu na poziom wapnia cytoplazmatycznego, podczas gdy inhibicja PFK-2 podnosiła poziom cytoplazmatycznego Ca2+ bez zmian w ROS (Supplementary Fig. S4a, b). Ponadto, nawet szybko proliferujące komórki nowotworowe (KLN205), były w stanie utrzymać stały poziom całkowitego ATP (Supplementary Fig. S4c, d) w obecności tych inhibitorów, przypuszczalnie wykorzystując inne składniki odżywcze, takie jak glutamina, zamiast aktywować wychwyt glukozy. Co ważne, ani 3-PO ani Alizarin Red S nie zaburzały cytoszkieletu F-aktyny ani nie indukowały DSBs (dane nie pokazane).
UM0112176 zaburza interakcje ALDOA-aktyna
Aldolaza jest znana z interakcji z aktyną i białkami wiążącymi aktynę8,9, wpływając na dynamikę cytoszkieletu. Może ona hamować zależną od WASP polimeryzację aktyny14 i prowadzić do defektu cytokinezy20, ale może również promować procesy zależne od aktyny, takie jak ruchliwość komórek nowotworowych nabyta w procesie transformacji EMT21. Ta złożona rola ALDOA wywołuje hipotezę, że wiązanie UM0112176 do ALDOA może być odpowiedzialne za obserwowane zaburzenia cytoszkieletu F-aktyny.
Zaburzenia cytoszkieletu są jednak specyficzne dla izoformy aktyny, ponieważ UM0112176 częściowo zaburza asocjację ALDOA z fibrylarną formą cytoszkieletu aktyny zawierającą izoformy β i γ (Fig. 3a), podczas gdy nie ma wpływu na stabilność mięśniowych (izomer α) polimerów aktyny (dane nie pokazane). W tratwach F-aktyna-aldolaza, kontakty F-aktyny z aldolazą znajdują się głównie w dwóch loci; regionie reszt 1-8 i reszt 350-36522. Sondy antygenowe zlokalizowały miejsca ścisłego wiązania aldolazy w konserwowanych C-końcowych regionach mikrofilamentów α-aktyny23. Symulacja dynamiki Browna wykazała, że podobne reszty aktyny biorą udział w wiązaniu aldolazy24. Ponieważ różnice w resztach 1-8 rozróżniają izoformy aktyny25, N-końcowy region aktyny napędza zatem specyficzne dla danej izoformy wiązanie z aldolazą. Wykazano również, że ALDOA preferencyjnie oddziałuje z aktyną γ w pulldown komórkowych lizatach komórek raka płuc26, potwierdzając, że kontakt ALDOA z N-końcowym regionem aktyny rozróżnia izoformy aktyny.
a Wywołana przez UM0112176 częściowa dysocjacja ALDOA od filamentów aktynowych β/γ w warunkach in vitro. Wartości podane są jako średnia i SD, *p < 0,05. b Wpływ różnych kombinacji UM0112176, ALDOA i kofiliny na depolimeryzację β/γ aktynu. c Wywołana przez UM0112176 dysocjacja ALDOA powoduje wiązanie i depolimeryzację F-aktyny w komórkach KLN205. d Wynik dokowania UM0112176 do ALDOA przy użyciu Autodock. Inhibitor UM0112176 oraz reszty C72, K293 i C338 pokazane są w stylu „stick style”, podczas gdy fałd ALDOA pokazany jest w stylu „cartoon style”. Wszystkie atomy tlenu są pokolorowane na czerwono, węgla na zielono, atomy siarki na żółto, a atomy azotu na niebiesko. Ładunki na powierzchni potencjału elektrostatycznego ALDOA są reprezentowane na niebiesko dla obszarów o ładunku dodatnim i na czerwono dla obszarów o ładunku ujemnym. Rysunek opracowany za pomocą PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC.) e, f Apocynina zmniejsza indukowane przez UM0112176 poziomy ROS odpowiednio w komórkach KLN205 i hNSCLC. g Wyciszanie NOX1 zmniejsza poziomy ROS w komórkach KLN205 traktowanych UM0112176. h Sygnał fluorescencyjny związany z NOX1 (zielony) przed i po wyciszeniu w komórkach KLN205. Jądra komórkowe były barwione DAPI (niebieski). Bar = 20 µm. Wykres po prawej stronie pokazuje spadek fluorescencji NOX1 po wyciszeniu. i Apocynina częściowo chroni wzrost poziomu wapnia po leczeniu UM0112716. j Wpływ apocyniny na aktywację kaspazy 3. Obraz przedstawia aktywowaną kaspazę 3 (zielony) w komórkach KLN205. Bar = 20 µm. k Apocynina zapobiega zaburzeniu cytoszkieletu aktynowego w komórkach traktowanych UM0112176. Bar = 20 µm
Interesująco, miejsce wiązania ALDOA pokrywa się z miejscem wiązania kofiliny na aktynie27,28, białka znanego z przyspieszania depolimeryzacji włókien aktyny29, którego wiązanie implikuje nakładanie się N- i C-końcowych reszt aktyny30. Biorąc pod uwagę duże, globularne kształty ALDOA i kofiliny, duże pozorne nakładanie się miejsc wiążących aktyny wskazuje na konkurencję ALDOA i kofiliny o te same miejsca wiązania na aktynie. Inkubacja F-aktyny (izoformy β-γ) zarówno z ALDOA, jak i z kofiliną (w równomolowych stężeniach podjednostkowych) wykazała niewielki wpływ kofiliny na stabilność F-aktyny (ryc. 3b), co wskazuje, że ALDOA chroniła F-aktynę przed działaniem kofiliny. Jest to zgodne z oczekiwanym silniejszym wiązaniem ALDOA do F-aktyny23 niż do kofiliny, której stała dysocjacji wynosi ∼ 10 μM31. Ochrona in vitro przez ALDOA przed depolimeryzacją aktyny wywołaną przez kofilinę została zniesiona przez dodanie UM0112176 (Rys. 3b). Chociaż ALDOA może oddziaływać z kofiliną in vitro, nie znaleźliśmy dowodów na to, by UM0112176 zaburzał tę interakcję (Supplementary Fig. S2b). Destabilizacja cytoszkieletu F-aktyny przez UM0112176 musi zatem wynikać z odłączenia ALDOA od jego loci wiążących na F-aktynie, które nakładają się z loci wiążącymi kofilinę, umożliwiając w ten sposób przyłączenie kofiliny do F-aktyny i pośrednicząc w jej depolimeryzacji. Zgodnie z tym, zaobserwowaliśmy brak kolokalizacji aktyny cytoszkieletowej i ALDOA w komórkach KLN205 traktowanych UM0112176 (Rys. 3c).
Aby zbadać interakcję UM0112176 z ALDOA (PDB: 1ZAJ) przeprowadzono ślepą analizę dokowania molekularnego. Obliczenia przy użyciu AutoDock32 wskazały 1 główny i 2 pomniejsze klastry dla UM0112176 na ALDOA. Główny klaster zawierał 17 póz o przewidywanej energii wiązania bliskiej ∼9.2 kcal/mol, podczas gdy mniejszy klaster zawierał po 3 póz o nieco niższej energii wiązania. Wizualna inspekcja umiejscowiła górną pozycję w pobliżu Lys-293 i Cys-338 (Rys. 3d), umożliwiając ich rotamerom wiązanie wodorowe, odpowiednio z grupami funkcyjnymi -C≡N i -Cl UM0112176. Modyfikacja Cys-72 i Cys-338 przez ich usieciowanie33 lub przez utleniony glutation hamuje aktywność katalityczną34 poprzez dalekosiężną komunikację z miejscem aktywnym odległym o ~25Å. Długodystansowe hamowanie dynamicznych zdarzeń podczas katalizy wymaganych dla aktywności ALDOA przez UM0112176, jak wykazano dla inaktywacji ALDOA przez utleniony glutation34, jest zgodne z jego kinetyką inhibicji. Co ciekawe, wykazano, że Lys-293 promuje interakcję γ-aktyny z ALDOA, ponieważ mutacja K293A znosi to wiązanie26. Ponadto, reszty obejmujące wnękę wiążącą UM0112176 pokrywają się z tymi, które wykazano dla raltegrawiru na ALDOA, a leczenie raltegrawirem (100 μM) przedłużyło przeżycie myszy ∼2-krotnie w stosunku do grupy kontrolnej26 w ortotopowym modelu raka płuc. Postawiliśmy hipotezę, że UM0112176 wykorzystuje zdolność do dysocjacji ALDOA z aktyny β/γ poprzez konkurowanie z γ-aktyną o interakcję z Lys-293 na ALDOA.
To odkrycie nie wyjaśnia jednak braku działania UM0112176 na cytoszkieletową aktynę w normalnych komórkach. Najwyraźniej w normalnych komórkach inne białka związane z aktyną muszą chronić cytoszkielet przed depolimeryzacją indukowaną przez kofilinę, ale w komórkach nowotworowych ta ochrona jest najwyraźniej uszkodzona. Poszukiwali¶my zatem czynników specyficznych dla nowotworów, które mogłyby przyspieszyć depolimeryzację cytoszkieletu aktynowego i być zdolne do indukowania apoptozy. Stwierdziliśmy, że jednym z wyraźnych efektów komórkowych aplikacji UM0112176 było bardzo szybkie nasilenie produkcji ROS, które wystąpiło wyłącznie w komórkach nowotworowych (Rys. 2a). Ponieważ wzrost poziomu ROS był równoczesny z modulacją struktury włókien F-aktyny35, skupiliśmy się na związanych z cytoszkieletem źródłach ROS, które mogą być specyficzne dla komórek nowotworowych.
Wzrost poziomu ROS po leczeniu UM0112176 jest spowodowany głównie przez aktywność NOX
Oksydaza zależna od NADPH (NOX) jest znaczącym źródłem wewnątrzkomórkowych ROS, które mogą być regulowane przez cytoszkielet aktyny36. Wykazano, że NOX1 bierze udział w przemianie nabłonkowo-mezenchymalnej, procesie ułatwiającym inwazję komórek nowotworowych37. Tak więc, postawiliśmy hipotezę, że indukowane przez UM0112176 przemieszczenie ALDOA z polimeryzowanej aktyny umożliwiło destabilizację cytoszkieletu pod kierunkiem kofiliny i że wynikająca z tego depolimeryzacja może być odpowiedzialna za wzrost ROS. Intrygująco, w większości komórek nowotworowych białka NOX (zwłaszcza izoforma NOX1) ulegają ekspresji na wyższym poziomie niż w komórkach prawidłowych38 (Supplementary Fig. S2c). Dlatego wyciszyliśmy ekspresję NOX1 w komórkach nowotworowych (ryc. 3h) lub zahamowaliśmy aktywność NOX1 za pomocą apocyniny39. Wynikające z tego zmniejszenie aktywności i ekspresji NOX1 zablokowało indukowane przez UM0112176 podniesienie poziomu ROS (Fig. 3e-g).
Ten zależny od aktyny mechanizm produkcji ROS sugeruje, że UM0112176 stymulując przemieszczenie ALDOA z filamentów aktyny umożliwia kofilinie depolimeryzację filamentów aktyny, a tym samym aktywację NOX. Produkcja ROS przez aktywowaną NOX, z kolei, umożliwia aktywację redox slingshot homolog 1 do dephosphorylate P-cofilin40. Rzeczywiście, dodanie UM0112176 zmniejszyło komórkowe poziomy P-kofiliny (Supplementary Fig. S5a). ALDOA zdysocjowany z filamentów aktynowych przez działanie UM0112176 promuje ich dalszą depolimeryzację poprzez uwolnienie dodatkowych miejsc wiążących dla zdeposforylowanej kofiliny, aby związać się z filamentami. Ten mechanizm feed-forward wyjaśniałby szybką depolimeryzację aktyny obserwowaną w komórkach KLN205 i hNSCLC.
Zaskakująco, apocynina tylko częściowo zatrzymała indukowany przez UM0112176 wzrost poziomu wapnia cytoplazmatycznego i nie chroniła przed aktywacją kaspazy 3 (Fig. 3i, j). Chociaż apocynina najwyraźniej hamowała przerwanie filamentów aktynowych przez UM0112176, cytoszkielet wydawał się bardziej zbity w porównaniu z komórkami nieleczonymi, a komórki wykazywały zmienioną morfologię, gdy były jednocześnie traktowane apocyniną i UM0112176 (Fig. 3k). Perturbacje cytoszkieletu przez UM0112176 lub w połączeniu z apocyniną są zgodne z zależną od NOX1 produkcją ROS dla prawidłowej organizacji cytoszkieletu w tych komórkach nowotworowych.
Komórkowy mechanizm działania UM0112176 obejmuje otwarcie mitoKATP
Białkiem, które potencjalnie może łączyć cytoszkielet aktyny z mitochondrialną produkcją ROS i apoptozą jest mitochondrialny ATP-zależny kanał potasowy (mitoKATP). Związek pomiędzy wewnątrzkomórkowym stężeniem K+ a apoptozą został udokumentowany w wielu systemach i dotyczy mitoKATP41. Kanał ten wydaje się być wrażliwy na depolimeryzację aktyny, która zwiększa jego otwarcie42,43 i powoduje łagodne rozłączenie i wzrost mitochondrialnej produkcji ROS44. Istnieje jednak kontrowersja w literaturze, z niektórymi wynikami sugerującymi, że raczej zaburzenie aktyny zamyka mitoKATP45.
Traktowaliśmy komórki nowotworowe wstępnie 5HD (5-Hydroxydecanoate), o którym wiadomo, że blokuje otwarcie mitoKATP44, i zaobserwowaliśmy, że 5HD znacznie zmniejszył indukowany przez UM0112176 wzrost ROS (ryc. 4a). Wstępne traktowanie 5HD nie było w stanie zablokować zakłócenia cytoszkieletu aktyny (ryc. 4b) i indukcji apoptozy przez UM0112176, chociaż znacznie spowolniło tempo aktywacji kaspazy 3 (ryc. 4c). Tak więc, UM0112176-driven depolimeryzacja aktyny cytoszkieletu może być odpowiedzialna za produkcję ROS zarówno przez otwarcie mitoKATP jak i, niezależnie, przez aktywację NOX1, która z kolei potęguje zaburzenia cytoszkieletu.
a 5HD hamuje poziom ROS w komórkach KLN205 traktowanych UM0112176. b 5HD nie chroni przed indukowanym przez UM0112176 zaburzeniem cytoszkieletu aktynowego (zielony). c Zmniejszona aktywacja kaspazy 3 (zielony) w komórkach poddanych działaniu 5HD przed inkubacją UM0112176. d, e Napływ Ca2+ z zewnętrznych źródeł po stymulacji UM0112176 odpowiednio komórek KLN205 i hNSCLC. f, g Wpływ inhibicji kanału mitoKATP na wzrost indukowany UM0112176 odpowiednio w komórkach KLN205 i hNSCLC. h Zmniejszenie indukowanego przez UM0112176 napływu wapnia po zahamowaniu NCX w komórkach KLN205. i Wpływ UM0112176 na interakcje HK2 (zielony) z mitochondriami (magenta) w komórkach nowotworowych KLN205 i prawidłowych komórkach HL-1. Aby lepiej zobrazować zmiany w lokalizacji HK2 w komórkach KLN205 (lewa strona panelu i), zielony kanał (HK2) jest przedstawiony oddzielnie od połączonych kanałów magenta (mitochondria) i niebieskiego (jądra). Dla komórek HL-1, biały kolor wskazuje lokalizację zielono zabarwionego HK2 i magenta zabarwionych mitochondriów. Bar = 20 µm
Odwrotny tryb wymiennika sodowo-wapniowego jest odpowiedzialny za indukowany przez UM0112176 napływ wapnia
UM0112176 wiążąc się z ALDOA wiązał się również ze znaczącym wzrostem poziomu wapnia komórkowego w komórkach nowotworowych, ale nie w normalnych (Ryc. 2b). Wzrost ten był szybszy w KLN205 (<5 min) niż w komórkach hNSCLC (~20 min) (Fig. S4g). Poszukiwaliśmy zatem pochodzenia tego wapnia i stwierdziliśmy, że pochodzi on z magazynu pozakomórkowego (ryc. 4d, e). Pozbawienie Ca2+ z medium hodowlanego zapobiegło indukowanemu przez UM0112176 wzrostowi wapnia komórkowego.
Pytaliśmy następnie, czy NOX1 i mitoKATP mogą synergistycznie regulować zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wolnego Ca2+. Rzeczywiście, inhibicja NOX1 częściowo chroniła przed indukowanym przez UM0112176 wzrostem poziomu Ca2+ (Rys. 3i), podczas gdy inhibicja otwarcia mitoKATP praktycznie zniosła ten wzrost (Rys. 4f, g). Ponieważ żadne z tych białek nie funkcjonuje jako kanał wapniowy lub wymiennik, muszą one funkcjonować jako regulatory (np. poprzez ROS) białek bezpośrednio zaangażowanych w homeostazę wapnia.
Aktywacja NOX może prowadzić do otwarcia mitoKATP, co z kolei może pośrednio stymulować tryb odwrotny wymiennika sodowo-wapniowego (NCXrev), promując napływ Ca2+ do komórek46. Dlatego sprawdziliśmy możliwy udział NCX w indukowanym przez UM0112176 wzroście wapnia. Rzeczywiście, zahamowanie NCXrev przez KB-R794346 zmniejszyło napływ wapnia (Fig. 4h). Jednak nie zapobiegło to indukcji apoptozy (Supplementary Fig. S5b).
Wykazano, że depolimeryzacja aktyny stymuluje aktywność NCXrev47 , co stanowi dalsze wsparcie dla NCX jako wymiennika odpowiedzialnego za napływ Ca2+ po dodaniu UM0112176.
W związku z tym można stwierdzić, że sprzężenie między NOX i mitochondrialnymi ROS48 aktywuje transportery błonowe, wymieniacz sodowo-wodorowy i kotransporter sodowo-wodorowęglanowy poprzez stymulację wrażliwej na ROS kaskady MAPK i kulminuje w napływie Ca2+ przez NCXrev49. Ponadto, przeciążenie cytoplazmatyczne Ca2+ aktywuje NOX50, a mitochondrialne ładowanie Ca2+ przez mitochondrialny uniporter wapnia przyspiesza mitochondrialną produkcję ROS51, tworząc w ten sposób pozytywną pętlę zwrotną, która utrzymuje wysoki poziom ROS i wapnia oraz indukuje apoptozę. Zahamowanie napływu Ca2+ przez inhibicję NCXrev (ryc. 4h) wspiera tezę, że otwarcie mitoKATP prowadzące do uwolnienia mitoROS do cytoplazmy52 stanowi kluczowe wydarzenie odpowiedzialne za apoptozę.
Specyficzny dla komórek nowotworowych spadek poziomu ATP po inhibicji ALDOA indukuje szybką dysocjację HK2 z mitochondriów
Ale UM0112176 hamował syntezę ATP we wszystkich liniach komórkowych, zmiany ATP były większe i szybsze w komórkach nowotworowych (Fig. 2c). Co ważne, w komórkach prawidłowych, ale nie nowotworowych, zmiany te były odwracalne po odstawieniu inhibitora (Supplementary Fig. S4e). Dodanie UM0112176 indukowało szybki spadek (<5 min) poziomu ATP w komórkach KLN205 (spadek o ∼40%) i hNSCLC (spadek o ∼20%) (Supplementary Fig. S4f), podczas gdy nie zaobserwowano takich zmian w komórkach prawidłowych (Supplementary Fig. S4f).
Ta dwufazowa kinetyka deplecji ATP indukowanej przez UM0112176 nasunęła pytanie o mechanizm odpowiedzialny za szybki spadek poziomu ATP w komórkach nowotworowych. Dlatego zbadaliśmy subkomórkową lokalizację heksokinazy 2 (HK2), której ekspresja jest podwyższona w większości komórek nowotworowych i która wymaga asocjacji z mitochondriami dla pełnej aktywności i wydajnej syntezy ATP przez mitochondria4,5. Zaobserwowaliśmy, że w komórkach nowotworowych, ale nie w normalnych komórkach, HK2 szybko oddzielił się od mitochondriów po leczeniu UM0112176 (Fig. 4i), a czas trwania tych zmian był skorelowany z czasem produkcji ROS. Tak więc, w szybko proliferujących komórkach nowotworowych, pierwsza faza zależnego od UM0112176 spadku poziomu ATP koreluje z szybkim odłączeniem HK2 od mitochondriów.
Wyciszenie ekspresji ALDOA (Supplementary Fig. S5c) rekapitulowało obserwacje wywołane traktowaniem UM0112176 (Supplementary Fig. S5d-f) i nie wykazało równoczesnego spadku poziomu ATP, co jest zgodne z wynikami przedstawionymi przez Lew i Tolan14,20. To przemawia za tym, że obserwowany spadek poziomu ATP nie jest konsekwencją niższej aktywności metabolicznej, ale pochodzi z księżycowych interakcji ALDOA z jego partnerami wiążącymi, które są hamowane przez UM0112176. Chang et al. zwrócili uwagę, że mutacja ALDOA K293A wpływa na interakcję ALDOA z γ-aktyną, ale nie pociąga za sobą zmian w strumieniu glikolitycznym26, wspierając naszą interpretację, że UM0112176 zakłóca interakcje księżycowe ALDOA.
Wpływ UM0112176 na komórki nowotworowe nie może być wyjaśniony przez akumulację FBP
Aby sprawdzić, czy obserwowane zmiany są związane z niemetaboliczną funkcją ALDOA, czy też były konsekwencją zahamowania aktywności enzymu, a tym samym akumulacji FBP, zbadaliśmy wpływ FBP na poziom ROS i ATP, jak również na strukturę cytoszkieletu. Chociaż wydajność dyfuzji transmembranowej FBP jest stosunkowo niska, może on być aktywnie i efektywnie transportowany przez różne komórki53,54. Zaobserwowaliśmy, że 20 mM, ale nie 5 mM zewnątrzkomórkowego FBP stymulowało produkcję ROS i destabilizowało strukturę cytoszkieletu w komórkach nowotworowych (Supplementary Fig. S3c, d), co jest zgodne z komunikacją na duże odległości między miejscem aktywnym aldolazy a miejscem wiązania UM0112176. Te same stężenia FBP miały tylko niewielki wpływ na normalne komórki (Supplementary Fig. S3c, d), odzwierciedlając trend obserwowany dla komórkowego traktowania UM0112176. Brak dostrzegalnych zmian w astrocytach zgadza się z wirtualnym brakiem NOX1 w tych komórkach (Supplementary Fig. S2c) i wzmacnia znaczenie produkcji ROS przez NOX1 w komórkach nowotworowych dla prawidłowej organizacji cytoszkieletu. Chociaż obecność niskiego poziomu NOX1 w normalnych komórkach, które nie ulegają apoptozie podczas leczenia UM0112176, może przemawiać przeciwko NOX1 nadającemu selektywność komórkom nowotworowym podczas leczenia UM0112176, wykazano, że pożywka hodowlana o niskiej zawartości glukozy (5 mM) uniemożliwiła izoformie NOX4 kierowanie się do tratw lipidowych w adipocytach, zachowując ją we frakcji błonowej o niskiej aktywności55. Ponieważ nasze eksperymenty z hodowlą komórkową były prowadzone przy użyciu stężeń glukozy, które modelują środowisko fizjologiczne (5 mM), obecność NOX1 w normalnych komórkach prawdopodobnie służy jakiejś innej funkcji niecytoszkieletowej.
UM0112176 zapobiega jądrowej lokalizacji ALDOA
Niespodziewanie, leczenie UM0112176 również spowodowało usunięcie ALDOA z jąder komórek nowotworowych (Supplementary Fig. S5g). Wykazano, że jądrowa lokalizacja ALDOA jest związana z progresją cyklu komórkowego17, jednak mechanizm transportu jądrowego ALDOA i jego znaczenie dla regulacji cyklu komórkowego wymaga dalszych badań.