Western Blot (WB) jest powszechną metodą wykrywania i analizy białek. Opiera się na technice, która polega na przenoszeniu, zwanym również blotowaniem, białek oddzielonych w procesie elektroforezy z żelu na membranę, gdzie mogą być one dokładnie uwidocznione. Procedura ta została po raz pierwszy opisana przez H. Towbina i wsp. w 1979 roku (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979), a dwa lata później nadał jej nazwę W. Neal Burnette (Burnette, 1981). Towbin i wsp. opisali elektroforetyczny transfer białek z żeli poliakrylamidowych na arkusze nitrocelulozy, gdzie dokładnie uzyskano oryginalny wzór żelu. Konfiguracja składa się ze standardowego zestawu siedmiu kroków, Rysunek 1.
Rysunek 1. Standardowe kroki w Western Blotting.
Próbki są przygotowywane i ładowane do żelu, a podczas elektroforezy ujemnie naładowane białka przesuwają się w kierunku dodatnio naładowanej anody. W celu dalszej analizy białek, są one przenoszone na membranę w procedurze zwanej blottingiem. Po przeniesieniu, membrana jest blokowana, aby zapobiec niepożądanym interakcjom pomiędzy membraną a białkiem w kolejnych etapach. Aby uwidocznić interesujące nas białko, membrana jest zwykle najpierw sondowana przy użyciu pierwotnego przeciwciała specyficznego dla białka, a następnie znakowanego przeciwciała wtórnego używanego do wykrywania. Wykonywany jest obraz membrany i wynik jest analizowany.
Dodając oddzielny roztwór markera do jednej ze studzienek w żelu, możliwe jest oszacowanie wielkości białka oprócz interakcji przeciwciał, które są używane do weryfikacji specyficznego białka. Separacja na żelu jest nie tylko spowodowana rozmiarem, ale również w pewnym stopniu zależy od ładunku molekularnego, obszarów hydrofobowych i stopnia denaturacji. Konfiguracja eksperymentu może być zróżnicowana na wiele sposobów, aby jak najlepiej dopasować się do konkretnego zapytania. Podczas analizy wyników należy wziąć pod uwagę różnice między pasami dotyczące obciążenia i szybkości transferu między pasami. Dodatkowo, nieliniowa zależność generowanego sygnału w zakresie stężeń próbek jest również aspektem, który należy rozważyć przy interpretacji wyników. Wynik eksperymentu WB zależy od trzech ważnych czynników: zdolności przeciwciała do wiązania specyficznego białka, siły interakcji oraz stężenia samego białka. Ponadto, istotną cechą jest również specyficzność wiązania do celu i niska reaktywność krzyżowa. Wynik badania nie zawsze jest łatwy do zinterpretowania, ponieważ wielkość białka może odbiegać od teoretycznej masy z powodu modyfikacji potranslacyjnych, takich jak glikozylacja, lub interakcji z innymi białkami. Jednakże, WB jest bardzo powszechną metodą i prawie wszystkie dostępne komercyjne przeciwciała zostały zwalidowane przy użyciu tej metody.
Technologia
Przygotowanie próbki
Pierwszym krokiem WB jest przygotowanie próbki, np. tkanki, komórek lub innego roztworu, który będzie analizowany. Zazwyczaj tkanka musi być rozdrobniona poprzez mieszanie, homogenizację lub sonikację. Dodawane są bufory w celu rozluźnienia komórek i rozpuszczenia białek. Często dodawany jest również inhibitor, aby zapobiec denaturacji lub degradacji. Do dalszego przygotowania próbek stosuje się różne metody filtracji i wirowania. Ważne jest, aby określić całkowite stężenie białka w wygenerowanym ekstrakcie, aby móc załadować określoną ilość na żel w celu umożliwienia porównania między próbkami. Zazwyczaj w celu określenia stężenia białka stosuje się analizę biochemiczną. Ekstrakt jest następnie rozcieńczany buforem obciążającym składającym się z glicerolu i barwnika (np. błękitu bromofenolowego). Glicerol jest używany w celu ułatwienia załadunku poprzez zwiększenie gęstości ekstraktu, a barwnik jest dodawany w celu wizualizacji próbki. Na próbki nakłada się ciepło w celu przerwania struktur białka, co pomoże w utrzymaniu ujemnego ładunku przed neutralizacją (Mahmood & Yang, 2012). Preferowane są kontrole dodatnie i ujemne, aby potwierdzić tożsamość białka, jak również aktywność przeciwciała.
Elektroforeza żelowa
Po przygotowaniu próbki ekstrakt jest gotowy do załadowania w celu oddzielenia białek w zależności od ich wielkości za pomocą elektroforezy żelowej. Do żelu przykładane jest pole elektryczne, które powoduje ruch naładowanych cząsteczek. W BŚ do rozdziału białek stosuje się żele poliakrylamidowe i dlatego metoda ta nazywana jest elektroforezą w żelu poliakrylamidowym (PAGE), gdy stosuje się warunki natywne. W przypadku warunków denaturujących, do systemu dodawany jest dodecylosiarczan sodu (SDS) i dlatego metoda ta nazywana jest SDS-PAGE. SDS wiąże się z białkiem i tworzy ujemnie naładowaną micelę wokół białka, niezależnie od jego ładunku. Warunki denaturujące rozpuszczają trójwymiarową strukturę białka, a ładunek białka staje się względny w stosunku do jego wielkości, co prowadzi do rozdzielenia białek tylko według wielkości. W warunkach natywnych ruchliwość jest zależna zarówno od ładunku jak i wielkości hydrodynamicznej, co pozwala na wykrycie zmian ładunku spowodowanych degradacją chemiczną, zmianami konformacyjnymi spowodowanymi składaniem lub rozkładaniem, agregacją lub innymi zdarzeniami wiążącymi.
Żel składa się zazwyczaj z dwóch sekcji o różnych gęstościach: (i) żelu układającego, oraz (ii) żelu rozdzielającego, Rysunek 2. Różnice pomiędzy tymi dwoma sekcjami polegają na pH i stężeniu żelu. Przy nieco kwaśnym pH i niższym stężeniu akrylamidu, żel układający słabo rozdziela białka, ale pozwala im tworzyć wysoko zdefiniowane ostre pasma przed przejściem do żelu rozdzielającego. Przy bardziej zasadowych warunkach i wyższym stężeniu żelu, żel rozdzielający powoduje, że białka są różnicowane według wielkości, ponieważ mniejsze białka poruszają się w żelu szybciej niż większe. Wygodne są żele prefabrykowane; możliwe jest jednak odlewanie ich ręcznie. Żel jest zanurzany w buforze, a próbki białek i markery są ładowane do studzienek w żelu. Do żelu przykłada się napięcie, a białka zaczną przemieszczać się w dół żelu dzięki ujemnemu ładunkowi elektrycznemu. Wybór odpowiedniego napięcia jest ważny, ponieważ zbyt wysokie napięcie spowoduje przegrzanie żelu i może zdeformować pasma.
Rysunek 2. Typowy żel zanurzony w buforze.
Blotowanie na membranę
Po elektroforezie żelowej białka przenoszone są na stałą membranę nośną, co jest trzecim etapem Western Blot. W procesie transferu stosuje się napięcie w celu przeniesienia białek z żelu na membranę. W skład zestawu wchodzą gąbki, bibuły filtracyjne, żel i membrana, która jest umieszczona pomiędzy żelem a elektrodą dodatnią, Rysunek 3. Zapewnia to migrację ujemnie naładowanych białek z żelu na membranę. Istnieją trzy rodzaje membran: nitroceluloza, dyfluorek poliwinylidenu (PVDF) i nylon. Chociaż membrany nylonowe są lepsze pod wieloma względami, wysokie wiązanie tła i nieodwracalne barwienie niektórych barwników sprawia, że ten rodzaj membran jest mniej popularny niż dwie pozostałe alternatywy. Główną zaletą membran nitrocelulozowych jest niskie tło, niezależnie od metody wykrywania. Ze względu na stosunkowo duży średni rozmiar porów, membrany nitrocelulozowe nie powinny być stosowane do przenoszenia białek o niskiej masie cząsteczkowej. Ponadto, po wyschnięciu membrany stają się kruche, co utrudnia ich obróbkę. Bardziej stabilna membrana PVDF umożliwia ponowne znakowanie i jest wygodniejsza w przechowywaniu. Hydrofobowa natura PVDF skutkuje wysoką zdolnością wiązania białek, jednak w konsekwencji tło jest również wyższe.
Rysunek 3. Białka w żelu są blotowane na membranę, a próbka jest wizualizowana poprzez blokowanie, dodawanie przeciwciał i płukanie zgodnie z określonym schematem.
Istnieją dwie metody blotowania zwane mokrą i półsuchą. Warunki mokre są preferowane, gdy transfer musi być wydajny i dawać wysoką jakość w odniesieniu do wyraźnych i ostrych pasm. Ponadto, jest to lepszy wybór dla transferu większych kompleksów białkowych. Żel, membrana i bibuła filtracyjna są całkowicie zanurzone w buforze podczas transferu i nie ma ryzyka wysuszenia żelu. Semi-dry blotting jest szybszy i wymaga mniejszej objętości buforu. Jednakże, ta metoda transferu jest zwykle mniej wydajna, szczególnie dla większych białek, i istnieje ryzyko przegrzania i wysuszenia żelu przy stosowaniu wydłużonych czasów transferu.
Sondowanie przeciwciał
Czwarty etap BŚ to sondowanie przeciwciał. Aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał do membrany, a nie wiązaniu specyficznemu do interesującego nas białka, używana jest substancja blokująca miejsca resztkowe na membranie. Powszechnie stosowane substancje to suszone mleko beztłuszczowe, 5% albumina surowicy bydlęcej (BSA) rozcieńczona w Tris Buffered Saline Tween (TBST), normalna surowica kozia, kazeina lub żelatyna rybia (Mahmood & Yang, 2012). Mleko jest łatwe do zdobycia i niedrogie, jednak nie nadaje się do wszystkich etykiet detekcyjnych. Żelatyna rybia daje niższe tło, ale może maskować niektóre białka, jak również jest stosunkowo drogim buforem blokującym. BSA jest niedrogi, podczas gdy surowica może zawierać immunoglobuliny powodujące reaktywność krzyżową. Staranny wybór środka blokującego jest kluczowy, ponieważ żaden z buforów blokujących nie jest idealny dla wszystkich różnych interakcji antygen-przeciwciało. Procedura blokowania polega na inkubacji membrany w odpowiednim buforze blokującym przez godzinę lub dłużej. W przypadku stosowania długich czasów inkubacji, blokowanie powinno być wykonywane w temperaturze +4°C, aby wykluczyć ryzyko wystąpienia artefaktów barwienia lub tła. Blokowanie jest delikatną równowagą pomiędzy redukcją tła bez zmniejszania sygnału z interesującego nas białka.
Zablokowana membrana jest następnie inkubowana z przeciwciałem pierwotnym. Przeciwciało jest rozcieńczane do odpowiedniego stężenia w TBST, soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) lub buforze płuczącym. Preferuje się inkubację przeciwciała z BSA, jeśli przeciwciało ma być użyte ponownie. Po przemyciu membrany, jest ona inkubowana z przeciwciałem drugorzędowym, które wiąże się z przeciwciałem pierwszorzędowym. Przeciwciało drugorzędowe jest znakowane reporterem. Przy stosowaniu przeciwciała poliklonalnego jako przeciwciała drugorzędowego, może ono powodować powstawanie tła. W przypadku barwienia tła, przeciwciało drugorzędowe może być wstępnie zablokowane nieimmunologiczną surowicą gospodarza, u którego zostało wytworzone. Optymalizacja stężenia przeciwciała drugorzędowego jest zalecana ze względu na dość duże różnice pomiędzy przeciwciałami, jak również stosowanymi systemami detekcji.
Detekcja
W piątym etapie BŚ, kompleks białko-przeciwciało jest wykrywany na membranie. Istnieje kilka rodzajów znakowania przeciwciała drugorzędowego, np. enzymy, fluorofory, biotynylacja, koniugacja ze złotem i radioizotopy, jak pokazano na Rysunku 4. Spośród enzymów najbardziej rozpowszechniony jest HRP stosowany wraz z substancjami chemiluminescencyjnymi, chemifluorescencyjnymi lub chromogennymi. HRP charakteryzuje się wysoką specyficznością substratową dającą niskie tło, jest stabilny i niedrogi. W chemiluminescencji enzym HRP katalizuje utlenianie luminolu z odczynnika do wykrywania nadtlenku luminolu. Ta wieloetapowa reakcja generuje emisję światła. Niektóre substancje chemiczne, takie jak fenole, mogą wzmocnić emitowane światło. Metodą bezpośrednią jest wykorzystanie fluorescencji; fluorofory emitują światło po wzbudzeniu i nie jest potrzebny środek detekcyjny. Jest ona odpowiednia do ilościowego Westernu, a ponieważ różne fluorofory emitują światło o różnej długości fali, możliwe jest przeprowadzenie multipleksowania i specyficznego wykrywania więcej niż jednego białka w tym samym czasie. Użycie substancji chemicznej i/lub enzymu do indukowania wytwarzania aktywnego fluoroforu z fluorogennego substratu nazywane jest chemifluorescencją. Aby dodatkowo zwiększyć intensywność sygnału, można zastosować dwuetapowy system oparty na biotynie i streptawidynie. Koniugacja złota jest również metodą, w której białka barwią się na ciemnoczerwono z powodu akumulacji złota. Możliwe jest również zastosowanie radioizotopów, ale wymagają one specjalnego postępowania i są dość drogie.
Rysunek 4. Różne systemy reporterowe.
Obrazowanie
Obrazowanie jest szóstym etapem WB i może być analogowe z użyciem kliszy lub cyfrowe z użyciem kamery CCD lub skanera rejestrującego różne rodzaje emitowanych sygnałów. Urządzenie obrazujące CCD umożliwia kwantyfikację z wysoką czułością wykrywania i szerokim zakresem liniowym bez odpadów chemicznych lub potrzeby ciemni. Może być używany do wykrywania membran, wybarwionych żeli lub do aplikacji w świetle ultrafioletowym.
Analiza
Ostatnim etapem WB jest analiza wyników. W typowym zastosowaniu jakościowym, obecność interesującego nas białka jest potwierdzana, ilość jest przybliżona poprzez oględziny, a rozmiar jest określany poprzez porównanie z markerem. Udoskonalenia i rozwój, szczególnie w kierunku wysoce czułych odczynników detekcyjnych i zaawansowanych technik obrazowania, czynią z WB potencjalne narzędzie do analizy ilościowej. Zastosowania ilościowe wymagają określenia ilości białka w kategoriach względnych lub bezwzględnych. Niektóre czynniki, takie jak czułość, stabilność sygnału, liniowy zakres dynamiczny, normalizacja i stosunek sygnału do szumu, muszą być wzięte pod uwagę. Minimalna ilość białka, która może być widoczna w danym teście to granica wykrywalności (LOD), a granica intensywności sygnału, która może być wiarygodnie wykorzystana do precyzyjnej kwantyfikacji to granica oznaczalności (LOQ). Czynniki, które wpływają na te pojęcia to jakość i stężenie przeciwciał, jak również czas ekspozycji, gdy rozważa się minimalną ilość wykrytego białka. Stabilny system sygnałowy rozszerza okno czasowe dla osiągnięcia wysokiej czułości, wielokrotnych ekspozycji i możliwości wykrywania słabych pasm. Zakres, który pozwala na równomierną i precyzyjną kwantyfikację, gdzie intensywność sygnału jest nadal proporcjonalna do ilości białka, nazywany jest liniowym zakresem dynamicznym. Ważne jest, aby uniknąć nasycenia sygnału spowodowanego zbyt dużą ilością białka lub wysokim stężeniem przeciwciał. Niska wartość LOD i oznaczanie ilościowe zarówno słabych, jak i silnych sygnałów daje szeroki liniowy zakres dynamiczny. Białko będące przedmiotem zainteresowania powinno być znormalizowane do wewnętrznego odniesienia, które pozwala na wahania w ilości białka załadowanego do każdego dołka lub różne stężenia. Można to osiągnąć za pomocą białek kontrolnych lub białek z domieszką. Stosunek między sygnałem a szumem jest ważny dla prawidłowego oznaczenia ilościowego białka. Ma to największe znaczenie przy wykrywaniu słabych pasm, gdzie spodziewane jest wyższe tło.
Szczególne przykłady
Mimo, że teoretyczna waga wielu białek różni się od rzeczywistej z powodu modyfikacji po translacji, prawie wszystkie komercyjne przeciwciała są walidowane przy użyciu BŚ.
W ramach projektu Human Protein Atlas, BŚ jest używana do kontroli jakości przeciwciał poliklonalnych generowanych w ramach projektu. Po oczyszczeniu, przeciwciała są używane do wykrywania pasm w zestawie lizatów i różnych tkanek. Obecnie wdrażane jest zastosowanie siRNA WB w celu dalszej analizy przeciwciał.
Cały protokół BŚ, włączając w to rozcieńczanie przeciwciał pierwotnych i wtórnych oraz końcowy etap detekcji, jest wykonywany w sposób rutynowy i nie dokonuje się specyficznej optymalizacji eksperymentalnej dla poszczególnych przeciwciał. Na początku, lizaty białek całkowitych z wybranych linii komórkowych i tkanek (15?g RT-4, U-251MG, wątroby i migdałków, jak również 25?g osocza pozbawionego HSA i IgG) oraz markera (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific) są ładowane na prefabrykowane żele gradientowe 4-20% Criterion SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories) i prowadzone w warunkach redukujących, a następnie przenoszone na membrany PVDF (Bio- Rad Laboratories) przy użyciu Trans-Blot turbo (Bio-Rad Laboratories) zgodnie z zaleceniami producenta. Żele gradientowe Criterion SDS-PAGE wraz z markerem pozwalają na analizę białek w zakresie wielkości od 10 do 250 kDa. Membrany są następnie aktywowane w metanolu przed blokowaniem (5% suche mleko, 0,5% Tween 20, 1× TBS; 1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl) przez 1 h w temperaturze pokojowej przy ciągłym wstrząsaniu. Membrany są następnie inkubowane z pierwotnym przeciwciałem HPA rozcieńczonym do ~0,6?g/ml, przez 1 h, po czym następuje płukanie (1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween) i inkubacja przez 45 minut z wtórnym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą (świńskie anty-rabbit 1:4000, Dako). W przypadku przeciwciał komercyjnych stosuje się rozcieńczenie 1:500, a przeciwciałem drugorzędowym jest albo świńskie przeciwciało anty-rabbitowe (1:3000, Dako), albo kozie przeciwciało anty-mysie (1:3000, Dako). Kamera CCD (Bio-Rad Laboratories) jest używana do wykrywania sygnału z substratu (Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate; Millipore).
Typowy Western Blot z HPA jest przedstawiony na Rysunku 5.
Rysunek 5. Typowy wynik Western Blot przy użyciu HRP i kamery CCD.
Bibliografia i linki
Artykuł wymieniający nazwę metody i opisujący ją bardziej szczegółowo:
Burnette WN., „Western blotting”: elektroforetyczne przenoszenie białek z żeli z dodecylosiarczanem sodu–poliakrylamidem na niemodyfikowaną nitrocelulozę i detekcja radiograficzna z przeciwciałem i radiojodowanym białkiem A. Anal Biochem. (1981)
PubMed: 6266278
W artykule opisano technikę Western Blotting, teorię i rozwiązywanie problemów:
Mahmood T et al., Western blot: technika, teoria, i rozwiązywanie problemów. N Am J Med Sci. (2012)
PubMed: 23050259 DOI: 10.4103/1947-2714.100998
Pierwszy artykuł opisujący elektroforetyczny transfer białek na membranę:
Towbin H et al., Elektroforetyczny transfer białek z żeli poliakrylamidowych na arkusze nitrocelulozy: procedura i niektóre zastosowania. 1979. Biotechnologia. (1992)
PubMed: 1422008
Western Blotting Principles and Methods – darmowy podręcznik udostępniony przez GE Healthcare:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooks
Western Blotting w projekcie Human Atlas Protein:
Western Blotting
Wikipedia – odpowiednie linki:
Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Ekcyklopedia Western blot – Wiele przydatnych informacji o Western blot, a także rozwiązywanie problemów, protokoły i dobór przeciwciał:
http://www.western-blot.us
Antibodypedia – Otwarta baza ogólnodostępnych przeciwciał i ich przydatności w różnych zastosowaniach:
http://www.antibodypedia.com
VIDEO: Western blotting krok po kroku, tutorial wykonany przy użyciu Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu
Wideo: Western blotting krok po kroku, tutorial wykonany przy użyciu Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu