In diesem Beitrag diskutieren wir das Phänomen der Beugung zweiter Ordnung durch einen Monochromator und die Probleme, die es in der Fluoreszenzspektroskopie verursachen kann.
Dies ist der zweite Teil einer Reihe von Blog-Beiträgen (lesen Sie den ersten Blog-Beitrag), in denen wir die häufigsten Fehler und experimentellen Artefakte diskutieren, die bei der Messung von Fluoreszenzspektren auftreten. Diese Liste wurde ursprünglich von der „Rogue’s Gallery of Fluorescence Artefacts and Errors“ in dem hervorragenden Buch „Introduction to Fluorescence“ von David M. Jameson inspiriert.1 Diese Blog-Beiträge werden auf dieser Liste aufbauen und die Erfahrungen unserer eigenen Betriebsingenieure und Applikationswissenschaftler mit den häufigsten Fehlern wiedergeben, die sie bei der Beantwortung von Kundenfragen, bei Laborbesuchen und… gelegentlich auch bei uns selbst beobachten.
Was ist Beugung zweiter Ordnung?
In der Fluoreszenzspektroskopie werden Monochromatoren zur Auswahl der Anregungs- und Emissionswellenlängen verwendet. Ein typisches Fluoreszenzspektrometer besteht aus zwei Monochromatoren; einem Anregungsmonochromator zur Auswahl der gewünschten Anregungswellenlänge und einem Emissionsmonochromator zur Auswahl der Wellenlänge, die den Detektor erreicht. Weitere Informationen zur Funktionsweise eines Fluoreszenzspektrometers finden Sie in unserem Artikel „Einführung in die Fluoreszenzmessung & Instrumentierung“.
Monochromatoren nutzen Beugungsgitter, um die gewünschte Wellenlänge aus dem einfallenden Breitbandlicht zu isolieren. Das breitbandige Licht wird auf das Beugungsgitter gestrahlt und die verschiedenen Wellenlängen, aus denen das Licht besteht, werden unter verschiedenen Winkeln gebeugt, um die Gittergleichung zu erfüllen,
wobei m die Ordnung der Beugung ist, λ ist die Wellenlänge des gebeugten Lichts, d ist der Rillenabstand des Gitters, ist der Winkel zwischen dem einfallenden Licht und der Gitternormalen, θί ist der Winkel zwischen dem gebeugten Licht und der Gitternormalen. Es ist ersichtlich, dass bei Konstanten jede Wellenlänge des Lichts unter einem anderen Winkel gebeugt wird, was dem Monochromator erlaubt, die gewünschte Wellenlänge zu isolieren. Es ist auch zu sehen, dass für konstantes und konstantes λ die Gleichung mit unterschiedlichen Winkeln erfüllt wird, abhängig von der Beugungsordnung m, die positive und negative ganzzahlige Werte annehmen kann (…-2, -1, 0, 1, 2…). Ein Wert von ±1 wird als Beugung erster Ordnung bezeichnet und tritt in der Nähe der Gitternormalen auf und ist die höchste Intensität. In ähnlicher Weise wird ein Wert ±2 als Beugung zweiter Ordnung bezeichnet und tritt in einem flacheren Winkel auf und ist schwächer in der Intensität. Die Beugung höherer Ordnungen folgt einem ähnlichen Muster mit zunehmendem Winkel weg von der Normalen und abnehmender Intensität.
In einem Monochromator wird nur die Beugung erster Ordnung (entweder +1 oder -1) verwendet, um die gewünschte Wellenlänge zu wählen, und die höheren Ordnungen sind unerwünscht. Aufgrund des breiten Spektrums an Wellenlängen, die gebeugt werden, sind die Winkelbereiche, die von der Beugung erster und zweiter Ordnung eingenommen werden, jedoch nicht eindeutig. Dies wird in Abbildung 1 veranschaulicht, in der der blaue Kegel den Winkelbereich darstellt, in dem das Licht erster Ordnung gebeugt wird, und der rote Kegel den Winkelbereich, in dem das Licht zweiter Ordnung gebeugt wurde, und es gibt einen gemeinsamen Überlappungsbereich zwischen diesen Bereichen. Dieser gemeinsame Bereich kann auch aus der Gittergleichung ersehen werden. Betrachten Sie Licht bei 600 nm, das 1. Ordnung gebeugt wird (m = 1, λ = 600 nm) und Licht bei 300 nm, das 2. Ordnung gebeugt wird (m = 2, λ = 300); es ist klar, dass die linke Seite der Gittergleichung für beide Fälle gleich ist und der Winkel des gebeugten Lichts daher gleich sein muss. Die Konsequenz daraus ist, dass, wenn der Monochromator so eingestellt ist, dass er 600 nm transmittiert, auch ein kleiner Teil des 300 nm Lichts transmittiert wird, was für die Fluoreszenzspektroskopie problematisch sein kann.
Das Auftreten von Beugung zweiter Ordnung in Fluoreszenzspektren
Die Beugung zweiter Ordnung ist ein besonderes Problem bei streuenden Proben wie Pulvern, Kristallen und kolloidalen Suspensionen. Um die Auswirkung der Beugung zweiter Ordnung auf Fluoreszenzspektren zu zeigen, wurde eine streuende Fluoreszenzprobe hergestellt, indem eine Lösung des Fluoreszenzfarbstoffs 2-Aminopyridin mit Ludox gemischt wurde, das eine kolloidale Suspension von Siliziumdioxid-Nanopartikeln ist und als Streuer dient. Die Lösung wurde bei 300 nm angeregt und das Emissionsspektrum über einen Bereich von 250 nm bis 950 nm, wie in Abbildung 2 dargestellt, mit dem Photolumineszenz-Spektrometer FLS1000 bei deaktiviertem Ordnungsfilter (siehe folgender Abschnitt) des Emissionsmonochromators gemessen.Der erste Peak bei 300 nm entspricht der Rayleigh-Streuung des 300-nm-Anregungslichts, das im Emissionsmonochromator erster Ordnung gebeugt worden ist. Darauf folgt die Fluoreszenz erster Ordnung des 1-Aminopyridins, die bei 380 nm einen Peak aufweist. Diese Peaks werden dann als Artefakte zweiter Ordnung mit einem Rayleigh-Streuungspeak bei 600 nm und einem Fluoreszenzpeak bei 760 nm wiederholt. Ein schwacher Rayleigh-Streuungspeak dritter Ordnung ist auch gerade bei 900 nm zu sehen. Die Verwechslung von Artefakten zweiter Ordnung mit echter Fluoreszenzemission ist ein häufiger Fehler bei unerfahrenen Fluoreszenzanwendern und war sogar die Ursache für fehlerhafte Berichte in der Literatur. Ein Beispiel dafür ist die Veröffentlichung einer Arbeit, die über neue schwache langwellige Emissionsbanden von Tryptophan und Tyrosin bei 675 nm und 600 nm berichtete, die zusätzlich zur bekannten UV-Emission dieser Proteinreste auftraten.3 Sechs Monate später veröffentlichten Hutnik et al. eine Widerlegung, die zeigte, dass die vermeintliche langwellige Fluoreszenz einfach die Beugung zweiter Ordnung der echten UV-Emission von Tryptophan und Tyrosin bei 340 nm und 300 nm war.4
Entfernung der Beugung zweiter Ordnung durch Ordnungsfilter
Das Verkennen und Veröffentlichen eines Artefakts zweiter Ordnung ist ein extremes Beispiel, aber ein häufigeres Problem ist, dass die Streuung zweiter Ordnung oft mit der gemessenen Fluoreszenzemission überlappt und das Spektrum verzerrt. Abbildung 3a zeigt das Emissionsspektrum der gleichen Ludox / 2-Aminopyridid-Probe, die in Abbildung 2 verwendet wurde, aber die Anregungswellenlänge wurde auf 240 nm verschoben und der Emissionsbereich eingeengt. Die Streuung zweiter Ordnung liegt nun bei 480 nm und überschneidet sich mit dem Schwanz der Fluoreszenz von 2-Aminopyridin, was eine genaue Messung des Spektrums verhindert.Die Lösung für dieses Problem ist die Verwendung von Ordnungsfiltern im Monochromator. Ordnungsfilter sind Langpassfilter, die nur Wellenlängen oberhalb der Cutoff-Wellenlänge des Filters durchlassen. Das Prinzip der Ordnungsfilter im Monochromator ist in Abbildung 4 dargestellt, wobei die Ordnungsfilter in einem Filterrad vor dem Ausgangsspalt montiert sind. Wenn der Monochromator so eingestellt ist, dass er 300 nm durchlässt, wird das Beugungsgitter so gedreht, dass das 300-nm-Beugungslicht auf den Austrittsspalt des Monochromators gerichtet ist, und das Filterrad wird so gedreht, dass sich kein Langpassfilter im Lichtweg befindet und das 300-nm-Licht wie gewünscht aus dem Monochromator austritt (linkes Bild). Wenn der Monochromator so eingestellt ist, dass er 600-nm-Licht überträgt, wird das Beugungsgitter so gedreht, dass gebeugtes 600-nm-Licht erster Ordnung auf den Ausgangsspalt gerichtet wird, das von einer kleinen Menge 300-nm-Licht zweiter Ordnung begleitet wird. Das Filterrad wird so gedreht, dass sich vor dem Ausgangsspalt ein 400-nm-Langpassfilter befindet, der das gewünschte 600-nm-Licht durchlässt und das unerwünschte 300-nm-Licht blockiert (rechtes Bild).
Der Vorteil von Ordnungssortierfiltern ist in Abbildung 3b zu sehen, wo das Spektrum mit dem nun aktivierten automatischen Ordnungssortierfilterrad des Emissionsmonochromators von FLS1000 neu vermessen wurde. Das Ordnungssortierfilter entfernt den Streuungspeak zweiter Ordnung bei 480 nm und man erhält das wahre Spektrum von 2-Aminopyridin. Die Spektrometer FLS1000 und FS5 von Edinburgh Instruments sind standardmäßig mit Filtern zur Ordnungssortierung sowohl am Anregungs- als auch am Emissionsmonochromator ausgestattet. Diese Filterräder sind standardmäßig aktiviert und arbeiten vollautomatisch, wobei die Fluoracle® -Software des FLS1000 und FS5 die geeigneten Filter auf der Grundlage der Wahl der Anregungswellenlänge und der Emissionswellenlängen auswählt. Diese automatischen Filterräder ermöglichen es dem Anwender, breite Fluoreszenzspektren zu messen, ohne dass er sich Sorgen machen muss, dass Artefakte zweiter Ordnung seine Messungen verfälschen.
Wir hoffen, dass dieser Blogbeitrag Ihnen geholfen hat, das Vorhandensein von Artefakten zweiter Ordnung in Fluoreszenzspektren zu verstehen und wie diese durch die Verwendung von Ordnungsfiltern vermieden werden können.
- Introduction to Fluorescence, D. M. Jameson, CRC Press (2014)
- Principles of Fluorescence Spectroscopy 3rd, J. R. Lakowicz, Springer (2006)
- Macías, M. C. Pinto, C. Gutiérrez-Mérino, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan Solutions, Biochem Int. 15, 961-969 (1987)
- M. Hutnik, A. G. Szabo, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan: a Classic Example of Second Order Diffraction, Biochem Int. 16, 587-591 (1988)
Spektrometer zur Vermeidung von Beugung zweiter Ordnung
Die Spektrometer FS5 und FLS1000 setzen den Standard in der stationären und zeitaufgelösten Photolumineszenz-Spektroskopie sowohl für die Grundlagenforschung als auch für Routineanwendungen im Labor. Für weitere Informationen zu unseren FLS1000 und FS5 kontaktieren Sie bitte ein Mitglied unseres Teams unter [email protected].
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