Wie funktioniert die rekombinante DNA-Technologie? Der zu untersuchende Organismus, der als DNA-Spender für die Analyse verwendet werden soll, wird als Spenderorganismus bezeichnet. Das grundlegende Verfahren besteht darin, die DNA aus einem Spendergenom zu extrahieren und in Fragmente zu zerschneiden, die ein bis mehrere Gene enthalten, und diese Fragmente einzeln in aufgeschnittene kleine, autonom replizierende DNA-Moleküle wie bakterielle Plasmide einfügen zu lassen. Diese kleinen zirkulären Moleküle dienen als Träger, oder Vektoren, für die DNA-Fragmente. Die Vektormoleküle mit ihren Inserts werden rekombinante DNA genannt, weil sie aus neuartigen Kombinationen von DNA aus dem Spendergenom (das aus einem beliebigen Organismus stammen kann) mit Vektor-DNA aus einer völlig anderen Quelle (in der Regel ein bakterielles Plasmid oder ein Virus) bestehen. Die rekombinante DNA-Mischung wird dann zur Transformation von Bakterienzellen verwendet, und es ist üblich, dass einzelne rekombinante Vektormoleküle ihren Weg in einzelne Bakterienzellen finden. Die Bakterienzellen werden ausplattiert und zu Kolonien heranwachsen gelassen. Eine einzelne transformierte Zelle mit einem einzelnen rekombinanten Vektor wird sich in eine Kolonie mit Millionen von Zellen teilen, die alle denselben rekombinanten Vektor tragen. Daher enthält eine einzelne Kolonie eine sehr große Population von identischen DNA-Inserts, und diese Population wird als DNA-Klon bezeichnet. Ein großer Teil der Analyse des geklonten DNA-Fragments kann in dem Stadium durchgeführt werden, in dem es sich im bakteriellen Wirt befindet. Später ist es jedoch oft wünschenswert, die geklonte DNA wieder in die Zellen des ursprünglichen Spenderorganismus einzubringen, um spezifische Manipulationen der Genomstruktur und -funktion durchzuführen. Daher sieht das Protokoll oft wie folgt aus:
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Die Klonierung ermöglicht die Vervielfältigung und Gewinnung eines spezifischen DNA-Abschnitts aus einer großen, komplexen DNA-Probe wie einem Genom.
Da die Spender-DNA in viele verschiedene Fragmente geschnitten wurde, werden die meisten Kolonien eine andere rekombinante DNA (d. h. ein anderes kloniertes Insert) tragen. Daher besteht der nächste Schritt darin, einen Weg zu finden, den Klon mit dem Insert zu selektieren, der das spezifische Gen enthält, an dem wir interessiert sind. Wenn dieser Klon erhalten wurde, wird die DNA in großen Mengen isoliert und das klonierte Gen von Interesse kann einer Reihe von Analysen unterzogen werden, die wir später in diesem Kapitel betrachten werden. Beachten Sie, dass die Klonierungsmethode funktioniert, weil einzelne rekombinante DNA-Moleküle in einzelne bakterielle Wirtszellen gelangen und diese Zellen dann die Aufgabe übernehmen, die einzelnen Moleküle zu großen Molekülpopulationen zu amplifizieren, die als chemische Reagenzien behandelt werden können. Abbildung 12-1 gibt einen allgemeinen Überblick über den Ansatz.
Abbildung 12-1
Die rekombinante DNA-Technologie ermöglicht es, einzelne DNA-Fragmente eines beliebigen Genoms in Vektor-DNA-Moleküle, wie z. B. Plasmide, einzufügen und in Bakterien individuell zu amplifizieren. Jedes amplifizierte Fragment wird alsDNA-Klon bezeichnet.
Der Begriff rekombinante DNA muss von den natürlichen DNA-Rekombinanten unterschieden werden, die durch Crossing-over zwischen homologen Chromosomen in Botheukaryoten und Prokaryoten entstehen. Rekombinante DNA in dem Sinne, wie sie in diesem Kapitel verwendet wird, ist eine unnatürliche Vereinigung von DNAs aus nicht homologen Quellen, meist aus verschiedenen Organismen. Einige Genetiker bevorzugen den alternativen Namen chimäre DNA, nach dem mythologischen griechischen Ungeheuer Chimera, das seit jeher als Symbol für eine unmögliche biologische Vereinigung, eine Kombination von Teilen verschiedener Tiere, steht. Ebenso ist rekombinante DNA eineDNA-Chimäre und wäre ohne die experimentelle Manipulation, die wir rekombinante DNA-Technologie nennen, unmöglich.
DNA-Isolierung
Der erste Schritt bei der Herstellung rekombinanter DNA ist die Isolierung von Donor- und Vektor-DNA.Allgemeine Protokolle für die DNA-Isolierung waren viele Jahrzehnte vor der Erfindung der rekombinanten DNA-Technologie verfügbar. Bei der Verwendung solcher Methoden wird der Großteil der aus dem Spender extrahierten DNA nukleäre genomische DNA in Eukaryonten oder kerngenomische DNA in Prokaryonten sein; diese Typen sind in der Regel die für die Analyse benötigten. Das Verfahren zur Gewinnung von Vektor-DNA hängt von der Art des Vektors ab. Bakterielle Plasmide sind häufig verwendete Vektoren, und diese Plasmide müssen von der bakteriellen genomischen DNA gereinigt werden. Ein Protokoll zur Extraktion von Plasmid-DNA durch Ultrazentrifugation ist in Abbildung 12-2 zusammengefasst. Die Plasmid-DNA bildet nach der Ultrazentrifugation in einem Cäsiumchlorid-Dichtegradienten mit Ethidiumbromid eine deutliche Bande. Die Plasmidbande wird gesammelt, indem ein Loch in das Kunststoffzentrifugenröhrchen gestanzt wird. Ein anderes Protokoll beruht auf der Beobachtung, dass bei einem bestimmten kalzinischen pH-Wert bakterielle genomische DNA denaturiert, Plasmide jedoch nicht. Durch anschließende Neutralisation wird die genomische DNA ausgefällt, die Plasmide bleiben jedoch in Lösung.Phagen wie λ können auch als Vektoren zum Klonen von DNA in bakteriellen Systemen verwendet werden. Phagen-DNA wird aus einer reinen Suspension von Phagen isoliert, die aus Aphagen-Lysat gewonnen wurde.
Abbildung 12-2
Plasmide wie die, die Gene für die Resistenz gegen das Antibiotikum Tetracyclin tragen (oben links), können von der bakteriellen chromosomalen DNA abgetrennt werden. Durch die unterschiedliche Bindung von Ethidiumbromid durch die beiden DNA-Arten wird die zirkuläre Plasmid-DNA (mehr…)
DNA schneiden
Der Durchbruch, der die rekombinante DNA-Technologie ermöglichte, war die Entdeckung und Charakterisierung von Restriktionsenzymen. Restriktionsenzyme werden von Bakterien als Abwehrmechanismus gegen Phagen produziert. Wichtig ist, dass Restriktionsenzyme nicht wahllos schneiden, sondern an spezifischen DNA-Zielsequenzen, was eine der wichtigsten Eigenschaften ist, die sie für die DNA-Manipulation geeignet machen. Jedes DNA-Molekül, vom Virus bis zum Menschen, enthält rein zufällig Restriktionsenzym-Zielstellen und kann daher in definierte Fragmente einer zum Klonen geeigneten Größe geschnitten werden. Restriktionsstellen sind für die Funktion des Organismus nicht relevant und würden in vivo nicht geschnitten werden, da die meisten Organismen keine Restriktionsenzyme besitzen.
betrachten wir ein Beispiel: Das Restriktionsenzym EcoRI (ausE. coli) erkennt die folgende Sechs-Nukleotid-Paar-Sequenz in der DNA eines beliebigen Organismus:
Diese Art von Segment wird als DNA-Palindrom bezeichnet, was bedeutet, dass beide Stränge die gleiche Nukleotidsequenz haben, aber in antiparalleler Ausrichtung.Viele verschiedene Restriktionsenzyme erkennen und schneiden spezifische Palindrome. Das Enzym EcoRI schneidet innerhalb dieser Sequenz, aber in einem Paar versetzter Schnitte zwischen den G- und A-Nukleotiden.
Dieser versetzte Schnitt hinterlässt ein Paar identischer einzelsträngiger „klebriger Enden“. Die Enden werden „sticky“ genannt, weil sie an eine komplementäre Sequenz Wasserstoffbrückenbindungen eingehen (kleben) können. Abbildung 12-3 zeigt, wie EcoRI einen einzelnen Schnitt in ein zirkuläres DNA-Molekül, z. B. ein Plasmid, durchführt: Der Schnitt öffnet den Kreis, und das entstandene lineare Molekül hat zwei klebrige Enden. Die Produktion dieser klebrigen Enden ist eine weitere Eigenschaft von Restriktionsenzymen, die sie für die rekombinante DNA-Technologie geeignet macht. Das Prinzip ist einfach, dass, wenn zwei verschiedene DNA-Moleküle mit dem gleichen Restriktionsenzym geschnitten werden, beide Fragmente mit den gleichen komplementären klebrigen Enden produzieren, so dass es möglich ist, DNA-Chimären zu bilden. Wenn also sowohl die Vektor-DNA als auch die Donor-DNA mit EcoRI geschnitten werden, können sich die klebrigen Enden des Vektors an die klebrigen Enden eines Donor-Fragments binden, wenn die beiden gemischt werden.
Abbildung 12-3
Das Restriktionsenzym EcoRI schneidet ein zirkuläres DNA-Molekül mit einer Zielsequenz, was zu einem linearen Molekül mit einzelsträngigen klebrigen Enden führt.
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Restriktionsenzyme haben zwei Eigenschaften, die in der rekombinanten DNA-Technologie nützlich sind: Erstens schneiden sie DNA in Fragmente mit einer für die Klonierung geeigneten Größe. Zweitens führen viele Restriktionsenzyme gestaffelte Schnitte durch, die einzelsträngige, klebrige Enden erzeugen, die der Bildung rekombinanter DNA förderlich sind.
Dutzende von Restriktionsenzymen mit unterschiedlichen Sequenzspezifitäten sind inzwischen identifiziert worden, von denen einige in Tabelle12-1 dargestellt sind. Sie werden feststellen, dass alle Zielsequenzen Palindrome sind, aber, wie EcoRI, machen einige Enzyme gestaffelte Schnitte, während andere bündige Schnitte machen. Auch bündige Schnitte, die keine klebrigen Enden haben, können zur Herstellung rekombinanter DNA verwendet werden.
Tabelle 12-1
Erkennungs-, Spalt- und Modifikationsstellen verschiedener Restriktionsenzyme.
DNA kann auch durch mechanische Scherung geschnitten werden. Zum Beispiel bricht das Schütteln der DNA in einem Mixer die langen, chromosomengroßen Moleküle in bündig endende, klonierbare Segmente auf.
DNA verbinden
Am häufigsten werden sowohl die Spender-DNA als auch die Vektor-DNA mit Hilfe eines Restriktionsenzyms verdaut, das klebrige Enden erzeugt, und dann in einem Reagenzglas gemischt, damit die klebrigen Enden der Vektor- und Spender-DNA aneinander binden und rekombinante Moleküle bilden können. Abbildung 12-4 zeigt einen Plasmidvektor, der eine einzelne EcoRI-Restriktionsstelle trägt; daher wandelt der Verdau mit dem Restriktionsenzym EcoRI die zirkuläre DNA in ein lineares Molekül mit klebrigen Enden um. Spender-DNA aus einer anderen Quelle (z. B. Drosophila) wird ebenfalls mit dem EcoRI-Enzym behandelt, um eine Population von Fragmenten zu erzeugen, die die gleichen klebrigen Enden tragen. Wenn die beiden Populationen gemischt werden, können sich die DNA-Fragmente aus den beiden Quellen vereinigen, da sich zwischen ihren klebrigen Enden Doppelhelices bilden.Es gibt viele aufgeklappte Vektormoleküle in der Lösung und viele verschiedeneEcoRI -Fragmente der Spender-DNA. Daher wird eine Vielzahl von Vektoren produziert, die verschiedene Donor-Inserts tragen. In diesem Stadium haben sich die klebrigen Enden zwar vereinigt, um eine Population chimärer Moleküle zu erzeugen, aber die Zucker-Phosphat-Rückgrate sind an zwei Positionen an jeder Verbindungsstelle noch nicht vollständig. Die Rückgrate können jedoch durch die Zugabe des EnzymsDNA-Ligase verschlossen werden, wodurch Phosphodiesterbindungen an den Verbindungsstellen entstehen (Abbildung 12-4b). Bestimmte Ligasen sind sogar in der Lage, DNA-Fragmente mit stumpf abgeschnittenen Enden zu verbinden.
Abbildung 12-4
Methode zur Erzeugung eines chimären DNA-Plasmids, das Gene enthält, die von fremder DNA stammen. (Aus S. N. Cohen, „The Manipulation of Genes. „Copyright © 1975 by Scientific American, Inc. All rightsreserved.)
Die ligierte rekombinante DNA gelangt durch Transformation in eine Bakterienzelle. Nachdem sie sich in der Wirtszelle befindet, ist der Plasmidvektor in der Lage, sich zu replizieren, da Plasmide normalerweise einen Replikationsursprung besitzen. Da das Donor-DNA-Insert nun aber Teil der Vektorlänge ist, wird die Donor-DNA automatisch zusammen mit dem Vektor repliziert. Jedes rekombinante Plasmid, das in eine Zelle gelangt, bildet mehrere Kopien von sich selbst in dieser Zelle. In der Folge finden viele Zyklen der Zellteilung statt und die rekombinanten Vektoren durchlaufen weitere Replikationsrunden, so dass die resultierende Bakterienkolonie Milliarden von Kopien des singulären Donor-DNA-Inserts enthält. Dieser Satz von amplifizierten Kopien des einzelnen Donor-DNA-Fragments ist der DNA-Klon (Abbildung 12-5).
Abbildung 12-5
Wie die Amplifikation funktioniert. Die Behandlung der Spender-DNA und des Vektors mit Restriktionsenzymen ermöglicht die Insertion einzelner Fragmente in die Vektoren. Ein einzelner Vektor gelangt in einen bakteriellen Wirt, wo durch Replikation und Zellteilung eine große Anzahl von Kopien des Donor-Fragments entsteht. (mehr…)