Effekte von Seitenketten bei der Helix-Nukleation unterscheiden sich von der Helix-Propagation

Ergebnisse und Diskussion

Unser Ansatz zur Beurteilung der Helix-Nukleation verwendet Wasserstoffbrückenbindungs-Surrogat (HBS) α-Helices, bei denen die N-terminale Hauptketten-Wasserstoffbindung durch eine kovalente Bindung ersetzt wird (Abb. 1B) (20). In früheren Berichten haben wir HBS-Helices beschrieben, in denen die Wasserstoffbrückenbindung durch eine Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindung ersetzt ist (21). Die Charakterisierung dieser synthetischen Helices durch CD- und 2D-NMR-Spektroskopie sowie Einkristall-Röntgenbeugungsanalyse zeigt, dass sie die Konformation von kanonischen α-Helices getreu nachahmen (21, 22). Wichtig ist, dass HBS-Helices in der Lage sind, intrazelluläre Protein-Protein-Wechselwirkungen zu hemmen, die durch α-helikale Domänen vermittelt werden, was die Hypothese unterstützt, dass diese Verbindungen die Struktur und Funktion von Protein-α-Helices nachbilden (23, 24). Um die Wirkung verschiedener Reste auf die α-Helixbildung zu analysieren, stellten wir ein HBS-Analogon mit einer Disulfidbindung her, dessen Bildungsraten unter wässrigen Bedingungen überwacht werden konnten (25). Wir vermuteten, dass die Bildungsraten dieser Bindung eine einzigartige Sonde für die Untersuchung biophysikalischer Parameter im Zusammenhang mit der Helixbildung darstellen würden. Da die Disulfid-HBS-Verknüpfung (dsHBS) die intramolekulare Wasserstoffbrückenbindung in α-Helices nachahmt, stellten wir die Hypothese auf, dass die Oxidation von Bisthiol (bt) zu Disulfid (ds) ein direktes Maß für die Helixnukleation darstellen würde (Abb. 1C). Die Raten der Helixbildung für Modellpeptide wurden mit ultraschnellen Spektroskopien gemessen und liegen im Nanosekundenbereich (14, 26⇓⇓-29). Die Raten der Disulfidbildung sind unter unseren Reaktionsbedingungen viel langsamer (in der Größenordnung von Minuten) (30). Die dramatisch langsamere Zeitskala für die Disulfidbildung deutet darauf hin, dass sequenzabhängige Unterschiede in der Geschwindigkeit der Disulfidbildung Präequilibriumspopulationen widerspiegeln: Reste mit höherer Keimbildungsneigung begünstigen die Disulfidbildung.

Disulfid-verknüpfte HBS-Helices können aus der Oxidation der übergeordneten Bisthiol-Peptide abgeleitet werden, was einen einfachen Ansatz zur Kontrolle der Konformation des Peptids ermöglicht (31⇓⇓-34). Unser erstes Peptiddesign basierte auf einem kurzen Segment der p53-Aktivierungsdomäne: XQEG*FSDLWKLLS (1), wobei X und G* die dsHBS-begrenzten Reste darstellen (35). Die p53-Sequenz wurde gewählt, weil sie relativ wenige Seitenkettenkontakte wie z. B. Ionenbrücken aufweist, die die Ergebnisse verfälschen könnten. Wir haben zuvor eine Reihe von p53-HBS-Analoga durch CD- und NMR-Spektroskopie charakterisiert, was uns erlaubt, potenzielle Aggregationsprobleme vorherzusagen, die stabilisierte Konstrukte beeinträchtigen können (36⇓-38). Das Bisthiol-p53-Peptid ist in wässrigen Puffern bei 295 K schwach helikal. Die CD-Spektroskopie (Abb. 2A) zeigt, dass das p53 dsHBS 1 im Vergleich zum parentalen bt-Peptid (25) stark helikal ist. Wir wählten A, G, D, I, K, L, P und V als Gastreste für diese Untersuchung aus. Diese Auswahl umfasst repräsentative aliphatische geradkettige und β-verzweigte Reste sowie positiv und negativ geladene Seitenketten.

Nach ersten Experimenten wurde Peptid 1 modifiziert, indem die nativen Glutaminsäure- und Phenylalaninreste durch Lysin bzw. Alanin ersetzt wurden, um 2Λ zu erhalten: XΛKG*ASDLWKLLS. Die neue Sequenz wurde entworfen, um potenzielle Seitenkettenwechselwirkungen zwischen den Gastresten (Λ) und der entsprechenden i + 3-Position zu vermeiden; Lysin wurde eingebaut, um die Wasserlöslichkeit des Wirts zu erhöhen. Die zweite Position wurde für die Einführung von Gästen gewählt, da die Konformation dieses Restes in die Helixinduktion nahe dem N-Terminus involviert ist (39, 40). Die helikale Konformation von ds-2A: XAKG*ASDLWKLLS wurde mit einer Kombination aus 1D-NMR, Gesamtkorrelationsspektroskopie und Rotations-Rahmen-Kern-Overhauser-Effekt-Korrelationsspektroskopie (ROESY) in wässrigen Lösungen untersucht (SI Text, Tabelle S1 und Abb. S1). Die ROESY-Spektren zeigten Kreuzpeaks des nuklearen Overhauser-Effekts (NOE), die auf eine helikale Struktur hinweisen, einschließlich sequentieller NH-NH (i und i + 1) und mehrerer NOEs mit längerer Reichweite (zwischen i und i + 3/i + 4) (SI-Text, Tabelle S2). Wichtig ist, dass alle ϕ-Dihedralwinkel des Rückgrats, berechnet aus den 3JNHCHα-Kopplungskonstanten, im erwarteten Bereich für helikale Konformationen liegen (SI-Text, Tabelle S1) (41, 42). Die für die Reste innerhalb des Makrozyklus beobachteten Kopplungskonstanten unterscheiden sich nicht vom Rest der Kette, was darauf hindeutet, dass die Disulfid-Beschränkung getreu eine α-helicale Konformation induziert. Die Lösungsstruktur von ds-2A wurde aus 48 ROESY-Kreuzpeaks und 11 berechneten ϕ-Winkeln mithilfe der Monte-Carlo-Konformationssuche in Macromodel 2014 bestimmt. Eine Überlagerung der 20 niedrigsten Energiestrukturen für ds-2A ist in Abb. 2B dargestellt. Bemerkenswert ist, dass der Disulfid-gebundene Makrozyklus den N-Terminus der α-Helix nicht stört. Insgesamt bestätigen die NMR-Studien zusammen mit der CD-Spektroskopie die Stabilisierung einer wichtigen α-Helix-Konformation in dsHBS-gebundenen Peptiden.

Die Bisthiol- und HBS-Peptide wurden wie in SI-Text, Abb. S2 gezeigt synthetisiert. Wir verwendeten milde Oxidationsbedingungen, bestehend aus 2 % (Vol./Vol.) DMSO, um die Bisthiole zu oxidieren (Abb. 2C) (25, 30). Um die eng verwandten Bisthiol- und dsHBS-Peptide in der HPLC zu trennen und die Thiolgruppen zu quenchen, behandelten wir das Reaktionsgemisch mit einem Maleimid-Derivat (43). Eine adäquate Trennung der Bisthiol- und Disulfidpeptide in der HPLC ermöglichte es uns, die Raten der Disulfidbildung für jede Sequenz aus der Analyse der HPLC-Peakflächen zu quantifizieren (Abb. 3A und Abb. S3). Die anfänglichen Raten der Disulfidbildung sind in Abb. 3B aufgetragen, und die tabellierten Daten sind in Tabelle 1 dargestellt.

Wir stellen fest, dass die Keimbildungsneigung von Alanin stärker ist als die von Glycin, während die Disulfidbindungsbildung mit Prolin als Gast zu langsam ist, um sie genau zu messen. Diese Ergebnisse stimmen mit bekannten Beziehungen überein: Glycin ist ein hochflexibler Rest, während Prolin die Helizität nur als N-Cap-Rest und nicht an anderen Positionen in der Helix unterstützt. Diese Ergebnisse zeigen auch, dass die Konformation des Makrozyklus die Raten der Disulfidbildung beeinflusst. Wären die Raten der Bindungsbildung unabhängig von der Makrozyklus-Konformation, würde die Substitution eines einzelnen Glycins anstelle eines Alanins keinen signifikanten Effekt verursachen. Es ist wahrscheinlich, dass die Peptidkette jenseits des vermeintlichen Makrozyklus die Präequilibriumskonformation beeinflusst, aber da das Bisthiol-Peptid größtenteils nicht-α-helikal ist, erwarten wir, dass dieser Effekt subtil und für jede Mutante gleich ist.

Leucin- und Alanin-Sequenzen sind in ihren Disulfidbildungsraten ähnlich, wie aus den Literaturwerten für die Neigung (Tabelle 1) zu erwarten wäre (6). Diese Ergebnisse liefern nützliche Metriken, um das Potenzial unseres synthetischen Modells als Sonde für die Helix-Nukleation abzuschätzen. Überraschenderweise zeigen unsere Untersuchungen, dass β-verzweigte Reste nicht nachteilig für die α-Helix-Keimbildung sind. In der Tat ist die Rate der Disulfidbildung mit Valin fast die gleiche wie die von Alanin und Leucin, während Isoleucin zu einer leichten Abnahme führt. Geladene Reste, Lysin und Aspartat, verlangsamen die Reaktionsgeschwindigkeit auf das Niveau von Glycin. Da Asparaginsäure ein bekannter Helixbrecher ist, während Lysin als helixstabilisierender Rest gilt (44, 45), deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass geladene Reste möglicherweise an Langstreckeninteraktionen beteiligt sind. Obwohl die Sequenzen dieser Studie entworfen wurden, um die Kontextabhängigkeit zu minimieren, können Backbone-Wechselwirkungen nicht vollständig ausgeschlossen werden. Die CD-Spektroskopie zeigt, dass fünf der acht dsHBS-Sequenzen einen sehr ähnlichen Helixgehalt aufweisen; die Substitution von Glycin, Prolin und Asparaginsäure senkt die Helizität (Abb. 3C). Wir vermuten, dass die helikale Stabilität der eingeschränkten Sequenz keine wesentliche Determinante für die Disulfidbildung ist. Der Vergleich der Lysin- und Asparaginsäuresequenzen unterstützt diese Hypothese, da diese Sequenzen ähnliche Raten der Disulfidbildung aufweisen, während die gebundenen Peptide unterschiedliche helikale Stabilitäten zeigen. Geladene Reste am Ende von Helices können die Helixstabilität positiv oder negativ beeinflussen, basierend auf ihren Wechselwirkungen mit dem Helix-Makrodipol (46). Solche makrodipolaren Wechselwirkungen sollten jedoch den Prozess der Helixnukleation nicht beeinflussen, da die Helix noch nicht organisiert ist.

Um theoretische Unterstützung für unsere experimentellen Beobachtungen zu erhalten, berechneten wir Aktivierungsbarrieren für die Bildung einer i zu i + 4 Wasserstoffbrückenbindung in Peptidsequenzen mit Hilfe von Metadynamiksimulationen (47, 48). Helix-Spiral-Übergänge wurden bereits früher mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen untersucht, um die Neigung zur Helixbildung und die Zeitskalen für die Keimbildung zu analysieren, aber unseres Wissens nach wurde der Effekt von Punktmutationen auf die Helixbildung noch nicht systematisch untersucht (28, 39, 49). Wir bestimmten den Einfluss verschiedener Reste auf die Bildung einer α-Wendung in einer acetylierten und methylamidierten Modellpeptidsequenz, Ac-AΛA-NHMe. Wir verwendeten Schrödingers 2012-Verteilung von Desmond 3.1 (50), um 50-ns-Metadynamik-Simulationen für das Tripeptid unter Verwendung des Amber-Kraftfeldes ff12SB und zugehöriger einwertiger Ionenparameter (51, 52) durchzuführen. Es wurden zweidimensionale Freie-Energie-Oberflächen bestimmt und Aktivierungsenergien durch Inspektion identifiziert (Abb. 4). Die Aktivierungsenergien stabilisieren sich mit zunehmender Simulationslänge, was darauf hindeutet, dass die Simulation bei 15 ns konvergiert (Abb. S4). Wir führten die Simulationen auch in dreifacher Ausführung durch und maßen den durchschnittlichen rmsd zwischen den resultierenden freien Energieflächen (Abb. S4). Die Analyse zeigt, dass alle Gast-(Λ)-Reste, außer Prolin, Flächenwinkel aufweisen, die den links- und rechtshändigen α-Helix-, β-Strang- und Polyprolin II (PPII)-Regionen des Ramachandran-Plots entsprechen (Abb. 4A). Der Plot für das prolinhaltige Tripeptid zeigt nur die α- und PPII-Minima (Abb. 4B). Die Plots für die anderen 18 Gastreste in Ac-AΛA-NHMe sind in Abb. S5 dargestellt. Der gewichtete Anteil der α-, β- und PPII-Populationen für verschiedene Gastreste ist in Abb. 4C aufgetragen. Um die Barriere für die Helixbildung zu berechnen, verglichen wir die Höhe des kürzesten Peaks zwischen dem niedrigsten Energiebecken, das den PPII- oder β-Dihedralwinkeln entspricht, und der α-helicalen Dihedral für jeden Rest (Abb. 4D). Die PPII-Dihedralwinkel erwiesen sich in unseren Berechnungen für die meisten Gastreste als die Konformation mit der niedrigsten Energie.

Die Ergebnisse dieser Berechnungen korrelieren mit den experimentellen Daten und deuten darauf hin, dass die Barriere zur Vororganisation der α-helicalen Konformation nicht den Propensity-Skalen folgt. Obwohl die Aktivierungsenergien die Ausgangspopulationen und Energieprofile der α- und β- bzw. PPII-Konformationen widerspiegeln, bieten sie einen Maßstab für die Abschätzung der rückstandsabhängigen Schwierigkeit, eine α-helicale Konformation anzunehmen. Die berechneten ∆G‡-Werte identifizieren Gastreste mit schnellen und langsamen Faltungsraten, lassen aber vermuten, dass die Raten einiger anderer nicht ohne weiteres unterscheidbar sind. Insgesamt unterstützen die Berechnungen die experimentellen Beobachtungen, dass helikale Neigungsskalen nicht auf die Helix-Nukleation anwendbar sind.