Eine Untersuchung der Auswirkungen von Antizentromer-Antikörpern auf den Embryo im Frühstadium

Abstract

Hintergrund. Früher haben wir festgestellt, dass Frauen mit positiven Antizentromer-Antikörpern ein beeinträchtigtes Potenzial der Eizellreifung und der Embryo-Spaltung zeigten; der mögliche Mechanismus hinter diesem Phänomen war noch unbekannt. Zielsetzung. Ziel der vorliegenden Studie war es daher, vorläufig zu untersuchen, ob ACA in die lebenden Embryonen eindringen und deren Entwicklungspotenzial durch In-vitro-Kokultur mit Mausembryonen beeinträchtigen kann. Methoden. Maus-Embryonen wurden entnommen und für die In-vitro-Kultur mit polyklonalem Antizentromerprotein A (CENP-A)-Antikörper verwendet; dann wurde ein Immunfluoreszenz-Assay durchgeführt, um das Eindringen des Antikörpers in die Embryonen zu bestimmen, und das Entwicklungspotential der Embryonen wurde beobachtet. Ergebnisse. Alle Embryonen, die mit Anti-CENP-A-Antikörper kultiviert wurden, zeigten Immunfluoreszenz am Zellkern, während keiner der Embryonen aus den Kontrollgruppen Immunfluoreszenz zeigte. Zusätzlich zeigten die mit Anti-CENP-A-Antikörper kultivierten Embryonen im Vergleich zu den Kontrollen eine signifikante Wachstumsbeeinträchtigung. Schlussfolgerung. Maus-Embryonen sind möglicherweise ein direktes Ziel für ACA in vitro vor der Implantation. Der genaue Mechanismus muss jedoch weiter aufgeklärt werden.

1. Einleitung

Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte Störungen der Eizellreifung und der frühen Embryonalentwicklung bei Frauen mit positiven Antizentromer-Antikörpern (ACA) in ihrem peripheren Blut . Kürzlich fanden wir heraus, dass Frauen, die positiv auf ACA reagierten, einen signifikant niedrigeren Prozentsatz an reifen Eizellen und eine geringere Embryonenspaltung aufwiesen als Frauen, die negativ auf ACA reagierten, was den potenziellen Einfluss von ACA auf die weibliche Fertilität verdeutlicht. ACA ist als eines der Mitglieder der ANAs bekannt. Es wurde erstmals 1980 als spezifischer Antikörper gegen das Zentromer im Serum von Patienten mit Kalzinose, Raynaud-Phänomen, Ösophagusdysmotilität, Sklerodaktylie und Teleangiektasie-Syndrom (CREST) entdeckt. Jetzt wurde ACA als ein effektiver diagnostischer Hilfsmarker für systemische Sklerose (SSc) anerkannt. Wie berichtet, sind Patientinnen mit SSc anfällig für verschiedene ungünstige Schwangerschaftsausgänge, einschließlich erhöhter Spontanabortrate, Frühgeburtlichkeit, kleine Babys und Unfruchtbarkeit . Darüber hinaus ist die Prävalenz von Unfruchtbarkeit bei Patientinnen mit SSc hoch und die Erfolgsrate bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit relativ gering, was weitere Untersuchungen erfordert.

Bereits in den 1990er Jahren versuchten Forscher, ACA in Mauseier zu mikroinjizieren, was zu Störungen der Chromosomenbewegung und -segregation führte. Es ist bekannt, dass der Kinetochor die Anheftungsstelle der Spindelmikrotubuli in der zentromerischen Region eines Chromosoms ist . Außerdem ist es die dynamische Struktur für Mitose, Meiose und andere wichtige Aktivitäten der Zellen . Daher wäre es vernünftig zu folgern, dass ACA die Meiose oder Mitose in lebenden Zellen stören könnte.

Das Zentromer ist ein DNA-Protein-Komplex, dessen Zusammenbau durch zentromerische Chromatine und deren assoziierten Proteinkomplex koreguliert wird. Das Zentromerprotein A (CENP-A) ist eines der konstitutiven Zentromerproteine mit relativ klaren biologischen Funktionen, das am meisten untersucht wurde; seine wichtige Rolle bei der Assemblierung und funktionellen Umsetzung des Zentromers wurde wiederholt verifiziert . Darüber hinaus wird CENP-A, ähnlich wie CENP-B, als ein Hauptzielantigen von ACA angesehen.

Es wurde spekuliert, dass ACA eines der ANAs sein könnte, die am engsten mit einer abnormalen Eizellreifung und Embryospaltung assoziiert sind. Daher war das Ziel der vorliegenden Studie, den potenziellen Einfluss von ACA auf Embryonen im Frühstadium mittels In-vitro-Kokultur mit Mausembryonen zu untersuchen.

2. Materialien und Methoden

2.1. Mausembryonen

Die Superovulation wurde bei gezüchteten ICR-Mäusen durch Stimulation mit trächtigem Stutenserum-Gonadotropin (10 IE intraperitoneal (i.p.)) und humanem Choriongonadotropin (10 IE i.p. nach 48 h) induziert und mit ICR-Männchen verpaart. Die weiblichen Mäuse wurden 24 h nach der Verpaarung getötet. Embryonen im Frühstadium wurden durch scharfe Dissektion der Eileiter gesammelt und in den Experimenten verwendet. Die Ethikkommission des First Affiliated Hospital of Sun Yat-Sen University genehmigte diese Studie.

2.2. In-vitro-Embryokultur

Die Embryonen wurden im Quinn’s serial medium (Sage, USA) kultiviert. Für die Antikörpergruppe wurde dem Medium ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper gegen Maus-CENP-A (bovines Serumalbumin und azidfrei, maßgeschneiderte Produkte von Abcam, Vereinigtes Königreich) zugesetzt. Die Antikörperkonzentration im Medium betrug 35 μg/mL (modifiziert auf Basis der Literatur ). Für die Gruppe mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (diente als Kontrolle) wurde dem Medium die PBS-Lösung (PBS-Tablette, Millipore, Merck, Deutschland) mit dem gleichen Volumen wie die Antikörperlösung zugegeben. Die Blindkontrollgruppe umfasste das Medium ohne jegliche Zusätze.

2.3. Immunfluoreszenz-Assay

Am zweiten und dritten Tag der Kultur wurden aus jeder Schale der drei Gruppen drei bis fünf Embryonen für den Immunfluoreszenz-Assay entnommen, um festzustellen, ob die Signale des Anti-CENP-A-Antikörpers in den Embryonen nach der Kokultur vorhanden waren. Die Verfahren für den Immunfluoreszenz-Assay waren wie folgt: Die Embryonen wurden in 4 % Polyoxymethylen fixiert und dann mit 0,5 % Triton X-100 (Sigma, USA) durchtränkt, gefolgt von einer Versiegelung in 5 % normalem Eselserum (Jackson Immunoresearch, USA). Danach wurden die Embryonen für 1 h mit 488-markiertem Esel-Antikaninchen-IgG (Invitrogen, UK, 1 : 1000 Verdünnung) inkubiert, gespült, mit 1 μg /mL DAPI (4,6-Diamidino-2-phenylindol, Dihydrochlorid, Cell Signaling Technology, USA) für 15 min inkubiert, erneut gespült und für die anschließende mikroskopische Beobachtung in einer Schale fixiert. Um falsch-positive Ergebnisse der Versuchsgruppe auszuschließen, wurden die Embryonen der Antikörpergruppe mit PBS anstelle von 488-markiertem Esel-Antikaninchen-IgG (Antikörpergruppe zur Kontrolle) inkubiert.

2.4. Entwicklung der kokultivierten Embryonen (Embryotoxizitäts-Assay)

Die Entnahme und Kultivierung der Embryonen für diesen Embryotoxizitäts-Assay war die gleiche wie zuvor beschrieben, außer dass die Embryonen für den gesamten Zeitraum von 3 Tagen in den Schalen blieben. Die Embryonen jeder Gruppe wurden am dritten und fünften Tag auf ihr Entwicklungsstadium untersucht (der erste Tag bezog sich auf den Tag der Eizellentnahme). Die folgenden Entwicklungsstadien wurden aufgezeichnet: 6- bis 8-Zellen-Stadium am dritten Tag und Blastozysten-, Morula-, 2- bis 8-Zellen- und atretisches Stadium am fünften Tag.

2.5. Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde mit SPSS 13 (SPSS, IL, USA) durchgeführt. Ein Chi-Quadrat-Test und ein Partitions-Chi-Quadrat-Test wurden zum Vergleich der qualitativen Daten verwendet. Ein Wert von weniger als 0,05 wurde beim Chi-Quadrat-Test zwischen den drei Gruppen als statistisch signifikant angesehen, und ein Wert von weniger als 0,0167 wurde verwendet, um statistische Signifikanz bei der Partition von Chi-Quadrat-Tests zwischen den Gruppen anzuzeigen.

3. Ergebnisse

3.1. Immunfluoreszenz

Alle Embryonen, die mit dem anti-CENP-A-Antikörper kultiviert wurden, zeigten eine starke Immunfluoreszenz in den Zellkernen, während keiner der Embryonen aus den PBS- und Blank-Kontrollgruppen sowie der Antikörpergruppe zur Kontrolle eine Immunfluoreszenz zeigte (Abbildung 1).

Abbildung 1

Immunfluoreszenzansichten von Embryonen, die mit anti-CENP-A-Antikörper kultiviert wurden (Originalvergrößerung ×400). Die Antikörper-Fluoreszenz war auf den Kernen der Blastomere in den Embryonen aus der Antikörper-Gruppe vorhanden, während keine signifikante Antikörper-Fluoreszenz in den Embryonen aus den Gruppen PBS, Blank-Kontrolle und Antikörper-Gruppe zur Kontrolle beobachtet wurde.

3.2. Embryotoxizitätstest

Im Vergleich zu den PBS- und Blanko-Kontrollgruppen war der Prozentsatz der Embryonen im 6- bis 8-Zell-Stadium am dritten Tag sowie im Blastula- und Morulastadium am fünften Tag in der Antikörpergruppe signifikant niedriger. Die Entwicklungspotentiale der Embryonen waren zwischen der PBS- und der Blank-Kontrollgruppe vergleichbar (Tabelle 1).

4. Diskussion

Im Jahr 1999 fanden Forscher heraus, dass alle Mausembryonen, die mit gereinigtem antinukleärem IgG kultiviert wurden, eine starke Immunfluoreszenz auf den embryonalen Zellen zeigten und im Vergleich zu denen, die mit Kontroll-Immunglobulinen kultiviert wurden, eine signifikante Wachstumsbeeinträchtigung oder den Tod erlitten. Dies deutet darauf hin, dass ANAs direkt an Embryonen in vitro binden können. Die genauen Epitope waren jedoch nicht bekannt, da keine Kernantigene oder Phospholipide in der Zona gefunden wurden. In Mäuse-Embryonen im 2-Zell-Stadium wird eine Reihe von Nukleoproteinen transient synthetisiert und verändert die embryonale Chromatinzusammensetzung, was darauf hindeutet, dass frühe Embryonen Epitope für ANA besitzen könnten. Darüber hinaus ist die Bindung relativ spezifisch, da Antithyreoid-Antikörper und Antikörper von gesunden Individuen keine Hinweise auf eine Bindung an Embryonen zeigen. Die Mikroinjektion von ACA-haltigem Serum in Mäuseozyten könnte die Chromosomenkongression behindern und einen meiotischen Arrest in der Interphase oder einen mitotischen Arrest in der Prometaphase verursachen .

In der vorliegenden Studie zeigten alle Embryonen, die mit polyklonalen Anti-CENP-A-Antikörpern kultiviert wurden, eine starke Immunfluoreszenz von Antikörpern gegen nukleäre Komponenten (von denen angenommen wurde, dass es sich um Anti-CENP-A-Antikörper handelte) und erfuhren eine offensichtliche Beeinträchtigung des embryonalen Wachstums, was darauf hindeutet, dass Mausembryonen vor der Implantation in vitro ein direktes Ziel für einige ACAs sein könnten. Darüber hinaus zeigten bei der Mehrheit der kokultivierten Embryonen immer nur ein oder einige der Blastomere Fluoreszenz. Möglicherweise verhindert die Dichte der Strukturen im und um das Zentromer die Zugänglichkeit für Anti-CENP-A-Antikörper, oder das Blastomer mit nachweisbarer Fluoreszenz neigte zur Apoptose und wies relativ lockere Strukturen auf, die die Zugänglichkeit für Anti-CENP-A-Antikörper ermöglichten. Der genaue Mechanismus muss jedoch noch weiter geklärt werden.

Obwohl es kein eindeutiges Konzept für das Eindringen von Antikörpern in die lebenden Zellen gibt und der Mechanismus noch unbekannt ist, lieferten diese Studien Hinweise auf das Eindringen von Antikörpern in die lebenden Zellen. Zum Beispiel konnte das Anti-Ribonukleoprotein-IgG selektiv in die T-Lymphozyten eindringen, während auf der Oberfläche der T-Lymphozyten relativ wenig Fc-Rezeptoren vorhanden waren. Dies deutet darauf hin, dass andere Mechanismen der Nicht-Fc-Regulation beteiligt sein könnten, die mit Antigen-ähnlichen Strukturen auf der Lymphozytenoberfläche assoziiert sein könnten, was bedeutet, dass die Ribonukleoprotein-Antikörper mit den Ribonukleoprotein-Antigenen auf der Zelloberfläche interagieren, um ihren Zugang in die lebenden Zellen zu regulieren .

In dieser Studie wurde auch festgestellt, dass das embryonale Entwicklungspotenzial nach der Kultur mit Anti-CENP-A-Antikörpern signifikant beeinträchtigt war, mit einem signifikant geringeren Anteil an Embryonen im 6- bis 8-Zell-Stadium am dritten Tag und im Blastula-Stadium am fünften Tag. Tatsächlich wurde in einer früheren Studie festgestellt, dass Mausembryonen, die mit gereinigtem IgG aus ANA-positivem Serum kultiviert wurden, ein signifikant beeinträchtigtes embryonales Entwicklungspotenzial aufwiesen. ANA konnte in subzelluläre Strukturen eindringen, die entsprechende Antigene enthielten, wo es Epitope in den wichtigen Funktionsregionen identifizieren und daran binden konnte. Diese Autoantikörper konnten die Funktion der Antigene sowohl in vivo als auch in vitro signifikant hemmen.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Embryonen, die mit Anti-CENP-A-Antikörpern kultiviert wurden, eine signifikante Wachstumsbeeinträchtigung oder den Tod erfuhren. Somit könnten Embryonen ein direktes Ziel für Anti-CENP-A-Antikörper sein.

Ethische Genehmigung

Die medizinische Ethikkommission des First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University genehmigte die Studie (Nr. 75).

Interessenkonflikte

Ying Ying, Xi Guo, Yiping Zhong und Canquan Zhou erklären, dass sie keine Interessenkonflikte haben.

Danksagungen

Diese Studie wurde unterstützt von der National Natural Science Foundation of China (Nr. 81701518), Guangzhou Science and Technology and Information Bureau (Nr. 2014J4100161), Science & Technology Project of Guangdong Province (no. 2013B021800271), und Population and Family Planning Commission of Guangdong Province (no. 20132048). Diese Studie wurde vom Schlüssellabor für Reproduktionsmedizin der Provinz Guangdong vom First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University unterstützt. Die Studie wurde auch von zwei Schlüssellabors des Third Affiliated Hospital der Guangzhou Medical University unterstützt; es handelte sich um das Schlüssellabor für wichtige geburtshilfliche Erkrankungen der Provinz Guangdong und das Schlüssellabor für Reproduktion und Genetik der Guangdong Higher Education Institutes.