Comment fonctionne la technologie de l’ADN recombinant ? L’organisme étudié, qui sera utilisé pour donner de l’ADN pour l’analyse, est appelé organisme donneur. La procédure de base consiste à extraire et à découper l’ADN d’un génome donneur en fragments contenant un ou plusieurs gènes et à permettre à ces fragments de s’insérer individuellement dans de petites molécules d’ADN ouvertes à réplication autonome, comme les plasmides bactériens. Ces petites molécules circulaires servent de supports, ou de vecteurs, pour les fragments d’ADN. Les molécules vectrices avec leurs insertions sont appelées ADN recombinant parce qu’elles consistent en de nouvelles combinaisons d’ADN provenant du génome donneur (qui peut provenir de n’importe quel organisme) avec de l’ADN vecteur provenant d’une source complètement différente (généralement un plasmide bactérien ou un virus). Le mélange d’ADN recombinant est ensuite utilisé pour transformer les cellules bactériennes, et il est courant que des molécules vecteurs recombinantes uniques se retrouvent dans des cellules bactériennes individuelles. Les cellules bactériennes sont placées et on les laisse se développer en colonies. Une cellule individuelle transformée avec un seul vecteur recombinant se divisera en une colonie de millions de cellules, toutes portant le même vecteur recombinant. Par conséquent, une colonie individuelle contient une très grande population d’insertions d’ADN identiques, et cette population est appelée un clone d’ADN. Une grande partie de l’analyse du fragment d’ADN cloné peut être effectuée au stade où il se trouve dans l’hôte bactérien. Plus tard, cependant, il est souvent souhaitable de réintroduire l’ADN cloné dans les cellules de l’organisme donneur d’origine pour effectuer des manipulations spécifiques de la structure et de la fonction du génome. Par conséquent, le protocole est souvent le suivant :
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Le clonage permet l’amplification et la récupération d’un segment d’ADN spécifique à partir d’un grand échantillon d’ADN complexe tel qu’un génome.
Dans la mesure où l’ADN donneur a été coupé en de nombreux fragments différents, la plupart des colonies porteront un ADN recombinant différent (c’est-à-dire un insert cloné différent). Par conséquent, l’étape suivante consiste à trouver un moyen de sélectionner le clone avec l’insert contenant le gène spécifique qui nous intéresse. Lorsque ce clone a été obtenu, l’ADN est isolé en vrac et le gène cloné qui nous intéresse peut être soumis à diverses analyses, que nous examinerons plus loin dans ce chapitre. Notez que la méthode de clonage fonctionne parce que des molécules d’ADN recombinant individuelles pénètrent dans des cellules hôtes bactériennes individuelles, puis ces cellules se chargent d’amplifier les molécules individuelles en de grandes populations de molécules qui peuvent être traitées comme des réactifs chimiques. La figure 12-1 donne un aperçu général de cette approche.
Figure 12-1
La technologie de l’ADN recombinant permet d’insérer des fragments individuels d’ADN de n’importe quel génome dans des molécules d’ADN vecteur, comme les plasmides, et de les amplifier individuellement dans des bactéries. Chaque fragment amplifié est appelé un clone d’ADN.
Le terme d’ADN recombinant doit être distingué des recombinants naturels d’ADN qui résultent du crossing-over entre chromosomes homologues chez les botheucaryotes et les procaryotes. L’ADN recombinant, au sens où il est utilisé dans ce chapitre, est une union non naturelle d’ADN provenant de sources non homologues, généralement d’organismes différents. Certains généticiens préfèrent l’appellation alternative d’ADN chimérique, d’après le monstre mythologique grec Chimère, qui est devenu à travers les âges le symbole d’une union biologique impossible, une combinaison de parties d’animaux différents. De même, l’ADN recombinant est une chimère d’ADN et serait impossible sans la manipulation expérimentale que nous appelons technologie de l’ADN recombinant.
Isolation de l’ADN
La première étape de la fabrication de l’ADN recombinant consiste à isoler l’ADN donneur et l’ADN vecteur.Des protocoles généraux d’isolation de l’ADN étaient disponibles plusieurs décennies avant l’avènement de la technologie de l’ADN recombinant. Avec l’utilisation de ces méthodes, la majeure partie de l’ADN extrait du donneur sera de l’ADN génomique nucléaire chez les eucaryotes ou de l’ADN génomique principal chez les procaryotes ; ces types sont généralement ceux qui sont requis pour l’analyse. La procédure utilisée pour obtenir l’ADN du vecteur dépend de la nature du vecteur. Les plasmides bactériens sont des vecteurs couramment utilisés, et ces plasmides doivent être purifiés à l’écart de l’ADN génomique bactérien. Un protocole d’extraction de l’ADN plasmidique par ultracentrifugation est résumé à la Figure 12-2. L’ADN plasmidique forme une bande distincte après ultracentrifugation dans un gradient de densité de chlorure de césium contenant du bromure d’éthidium. La bande plasmidique est recueillie en perçant un trou dans le tube de centrifugation en plastique. Un autre protocole repose sur l’observation que, à un pH alcalin spécifique, l’ADN génomique bactérien se dénature mais pas les plasmides. Une neutralisation ultérieure précipite l’ADN génomique, mais les plasmides restent en solution.Les phages tels que le λ peuvent également être utilisés comme vecteurs pour cloner l’ADN dans les systèmes bactériens. L’ADN phagique est isolé à partir d’une suspension pure de phages récupérés à partir d’un lysat d’aphage.
Figure 12-2
Des plasmides tels que ceux portant des gènes de résistance à l’antibiotique tétracycline (en haut à gauche) peuvent être séparés de l’ADN chromosomique bactérien. Parce que la liaison différentielle du bromure d’éthidium par les deux espèces d’ADN rend l’ADN plasmidique circulaire (suite…)
Coupure de l’ADN
La percée qui a rendu possible la technologie de l’ADN recombinant a été la découverte et la caractérisation des enzymes de restriction. Les enzymes de restriction sont produites par les bactéries comme un mécanisme de défense contre les phages. Les enzymes agissent comme des ciseaux, coupant l’ADN du phage et l’inactivant ainsi. Il est important de noter que les enzymes de restriction ne coupent pas au hasard ; elles coupent plutôt des séquences cibles d’ADN spécifiques, ce qui est l’une des caractéristiques clés qui les rendent aptes à la manipulation de l’ADN. Toute molécule d’ADN, qu’elle soit virale ou humaine, contient des sites cibles d’enzymes de restriction par pur hasard et peut donc être coupée en fragments définis d’une taille adaptée au clonage. Les sites de restriction ne sont pas pertinents pour la fonction de l’organisme, et ils ne seraient pas coupés in vivo, car la plupart des organismes ne possèdent pas d’enzymes de restriction.
Regardons un exemple : l’enzyme de restriction EcoRI (deE. coli) reconnaît la séquence suivante de six paires de nucléotides dans l’ADN de n’importe quel organisme :
Ce type de segment est appelé palindrome d’ADN, ce qui signifie que les deux brins ont la même séquence de nucléotides mais dans une orientation antiparallèle.De nombreuses enzymes de restriction différentes reconnaissent et coupent des palindromes spécifiques. L’enzyme EcoRI coupe à l’intérieur de cette séquence, mais en une paire de coupes décalées entre les nucléotides G et A.
Cette coupe décalée laisse une paire de « extrémités collantes » monocaténaires identiques. Les extrémités sont dites collantes car elles peuvent se lier par hydrogène (coller) à une séquence complémentaire. L’illustration 12-3 montre EcoRI effectuant une seule coupure dans une molécule d’ADN circulaire telle qu’un plasmide : la coupure ouvre le cercle et la molécule linéaire formée comporte deux extrémités collantes. La production de ces extrémités collantes est une autre caractéristique des enzymes de restriction qui les rend adaptées à la technologie de l’ADN recombinant. Le principe est simple : si deux molécules d’ADN différentes sont coupées avec la même enzyme de restriction, elles produiront toutes deux des fragments avec les mêmes extrémités collantes complémentaires, ce qui rend possible la formation de chimères d’ADN. Ainsi, si l’ADN vecteur et l’ADN donneur sont coupés avec EcoRI, les extrémités collantes du vecteur peuvent se lier aux extrémités collantes d’un fragment donneur lorsque les deux sont mélangés.
Figure 12-3
L’enzyme de restriction EcoRI coupe une molécule d’ADN circulaire portant une séquence cible, ce qui donne une molécule linéaire avec des extrémités collantes simple brin.
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Les enzymes de restriction ont deux propriétés utiles dans la technologie de l’ADN recombinant.Premièrement,elles coupent l’ADN en fragments d’une taille adaptée au clonage. Deuxièmement,beaucoup d’enzymes de restriction effectuent des coupures décalées qui créent des extrémités soyeuses à simple brin propices à la formation d’ADN recombinant.
Des dizaines d’enzymes de restriction avec différentes spécificités de séquence ont maintenant été identifiées, dont certaines sont présentées dans le tableau12-1. Vous remarquerez que toutes les séquences cibles sont des palindromes,mais, comme EcoRI, certaines enzymes effectuent des coupes décalées, tandis que d’autres effectuent des coupes affleurantes. Même les coupes affleurantes, qui ne présentent pas d’extrémités collantes, peuvent être utilisées pour fabriquer de l’ADN recombinant.
Tableau 12-1
Reconnaissance, clivage et sites de modification de diverses enzymes de restriction.
L’ADN peut également être coupé par cisaillement mécanique. Par exemple, l’agitation de l’ADN dans un mélangeur fragmentera les longues molécules de la taille d’un chromosome en segments clonables à extrémités affleurantes.
Jonction de l’ADN
Le plus souvent, l’ADN donneur et l’ADN vecteur sont digérés à l’aide d’une enzyme de restriction qui produit des extrémités collantes, puis mélangés dans un tube à essai pour permettre aux extrémités collantes de l’ADN vecteur et de l’ADN donneur de se lier l’une à l’autre et de former des molécules recombinantes. La figure 12-4 montre un vecteur plasmidique qui porte un seul site de restriction EcoRI ; la digestion avec l’enzyme de restriction EcoRI convertit donc l’ADN circulaire en une molécule linéaire à extrémités collantes. L’ADN donneur d’une autre source (par exemple, la drosophile) est également traité avec l’enzyme EcoRI pour produire une population de fragments portant les mêmes extrémités collantes. Lorsque les deux populations sont mélangées, les fragments d’ADN des deux sources peuvent s’unir, car des doubles hélices se forment entre leurs extrémités collantes.Il y a beaucoup de molécules vecteurs ouvertes dans la solution, et beaucoup de fragments d’ADN donneur différents. Il y a beaucoup de molécules de vecteur ouvertes dans la solution et beaucoup de fragments d’ADN donneur différents d’EcoRI. A ce stade, bien que les extrémités collantes se soient unies pour générer une population de molécules chimériques, les squelettes sucre-phosphate ne sont pas encore complets à deux positions à chaque jonction. Cependant, les squelettes peuvent être scellés par l’ajout de l’enzyme ADN ligase, qui crée des liaisons phosphodiester aux jonctions (figure 12-4b). Certaines ligases sont même capables de joindre des fragments d’ADN aux extrémités coupées.
Figure 12-4
Méthode pour générer un plasmide d’ADN chimérique contenant des gènes dérivés d’un ADN étranger. (Extrait de S. N. Cohen, « The Manipulation of Genes », Copyright © 1975 by Scientific American, Inc. Tous droits réservés).
Amplification de l’ADN recombinant
L’ADN recombinant ligaturé entre dans une cellule bactérienne par transformation. Une fois dans la cellule hôte, le vecteur plasmidique est capable de se répliquer car les plasmides ont normalement une origine de réplication. Cependant, maintenant que l’insert d’ADN donneur fait partie de la longueur du vecteur, l’ADN donneur est automatiquement répliqué en même temps que le vecteur. Chaque plasmide recombinant qui entre dans une cellule va former de multiples copies de lui-même dans cette cellule. Par la suite, de nombreux cycles de division cellulaire auront lieu, et les vecteurs recombinants subiront d’autres cycles de réplication. La colonie de bactéries qui en résultera contiendra des milliards de copies de l’insert d’ADN donneur unique. Cet ensemble de copies amplifiées de l’unique fragment d’ADN donneur est le clone d’ADN (figure 12-5).
Figure 12-5
Comment fonctionne l’amplification. Le traitement par enzyme de restriction de l’ADN du donneur et du vecteur permet l’insertion de fragments uniques dans les vecteurs. Un vecteur unique entre dans un hôte bactérien, où la réplication et la division cellulaire donnent lieu à un grand nombre de copies du fragment du donneur. (suite…)