Cibler une fonction de clair de lune de l’aldolase induit l’apoptose dans les cellules cancéreuses

Depuis la découverte d’Otto Warburg que les cellules cancéreuses présentent un taux extrêmement élevé d’absorption de glucose et de production de lactate1, une multitude d’études ont démontré que la majorité des cellules cancéreuses dépendent de la production d’énergie glycolytique2. Cela a stimulé les laboratoires du monde entier à rechercher des inhibiteurs de la glycolyse comme médicaments anticancéreux potentiels.

Cependant, la signification biologique de la très forte expression des enzymes glycolytiques dans les cancers reste énigmatique. La première enzyme de la glycolyse, l’hexokinase, est exprimée à un niveau plus faible par rapport aux enzymes successives3, et possède une activité spécifique et une affinité pour les substrats relativement faibles4,5. Ainsi, son activité totale limite le flux à travers la glycolyse. Par conséquent, la surabondance d’enzymes glycolytiques dans les cellules cancéreuses ne peut pas favoriser un catabolisme plus rapide du glucose mais doit être associée à d’autres processus non catalytiques.

Les enzymes glycolytiques appartiennent aux enzymes  » moonlighting « 6,7 dont le rôle physiologique ne se limite pas à la fonction catalytique et qui peuvent agir comme régulateurs d’une variété de processus cellulaires. Nous présentons des preuves qu’une enzyme glycolytique, l’aldolase, peut être une cible puissante dans la thérapie anticancéreuse et que la perturbation d’un réseau complexe d’interactions intracellulaires médiées par l’enzyme est critique pour son action anticancéreuse.

L’aldolase est positionnée à mi-chemin de la voie glycolytique et catalyse le clivage réversible du fructose-1,6-bisphosphate (FBP) en dihydroxyacétone-3-phosphate et en glycéraldéhyde-3-phosphate. Son isoforme musculaire (ALDOA), qui est l’isoforme d’aldolase la plus abondante dans presque tous les cancers8, peut organiser les filaments d’actine9,10, affecter les activités de l’AMPK11,12 et du FBP213, et réguler la signalisation Wnt14,15 et p5316. Il a également été démontré que l’ALDOA est impliquée dans la progression de la phase S/G1 du cycle cellulaire17. Puisque l’ALDOA participe à de nombreux événements cellulaires nécessaires à la survie et à la prolifération des cellules cancéreuses, nous avons émis l’hypothèse que la perturbation des fonctions de clair de lune de l’ALDOA pourrait constituer une cible privilégiée pour la thérapie anticancéreuse.

Nos résultats révèlent que dans les cellules cancéreuses mais pas dans les cellules normales, la perturbation de l’interaction de l’ALDOA avec le cytosquelette d’actine provoque une séquence de changements intracellulaires, y compris une élévation significative de la production de ROS, l’arrêt de la synthèse d’ATP et l’augmentation des niveaux de calcium, ce qui entraîne l’activation des caspases et le blocage de la prolifération cellulaire. Le mécanisme de ces changements étant indépendant de la fonction catalytique de l’ALDOA, nous concluons que la surexpression de l’ALDOA dans les cellules cancéreuses n’est pas liée à leurs besoins glycolytiques élevés mais représente une adaptation par laquelle les cellules cancéreuses métastatiques assurent l’intégrité de leur cytosquelette d’actine tout en subissant la transition épithélio-mésenchymateuse. Ainsi, le mécanisme d’action présenté ici pourrait avoir des implications significatives pour le développement de nouvelles thérapies anticancéreuses à large base.

L’UM0112176-un nouvel inhibiteur de l’ALDOA-réduit significativement la croissance des cellules cancéreuses

Pour perturber l’interaction de l’ALDOA avec ses partenaires de liaison, nous avons utilisé un inhibiteur mixte de l’ALDOA à liaison lente (UM0112176 ; figure supplémentaire S1a) que nous avons trouvé par criblage à haut débit de la grande bibliothèque de composés de l’Université de Montréal. UM0112176 a inhibé l’activité de l’ALDOA humaine avec une IC50 ∼ 2-5 μM de manière à se lier lentement (figures supplémentaires S1b, c), sans inhiber les autres enzymes glycolytiques (figure supplémentaire S1d). Nous avons vérifié la capacité d’UM0112176 à inhiber l’activité de l’ALDOA in vivo en déterminant les niveaux cellulaires de fructose-1,6-bisphosphate et de triose phosphates après 24 heures d’incubation des cellules en présence de l’inhibiteur (figure supplémentaire S1e). Les résultats ont montré une augmentation significative du titre du substrat de l’ALDOA et une forte diminution des produits de réaction de l’ALDOA tant dans les cellules cancéreuses (KLN205, cancer squameux du poumon de souris) que dans les cellules normales (culture primaire d’astrocytes de rat). Ceci est soutenu par la tendance inverse observée en utilisant des milieux de culture cellulaire contenant uniquement de la glutamine.

Puis, nous avons déterminé une courbe dose-réponse de l’UM0112176 et avons constaté que 10 µM d’UM0112176 réduisait fortement la croissance de toutes les lignées cellulaires cancéreuses testées : KLN205, hNSCLC (lignée cellulaire de cancer du poumon humain non à petites cellules), BxPC3 (adénocarcinome pancréatique humain) et AsPC1 (métastase d’ascite d’adénocarcinome pancréatique humain) (figure 1a). Le taux de croissance des lignées cellulaires normales (astrocytes de rat, cardiomyocytes de souris – lignée cellulaire HL-1, et une lignée cellulaire épithéliale humaine – ME16C) n’a pratiquement pas été affecté par 10 µM d’UM0112176 (Fig. 1a). Un traitement prolongé de 7 jours avec 10 µM d’UM0112176 a divisé par quatre le nombre de cellules cancéreuses alors que le nombre de cellules normales n’a diminué que de 25 à 30 % (Fig. 1b).

Pour distinguer si l’inhibition du taux de croissance cellulaire était due à une mortalité élevée ou à un blocage de la prolifération, nous avons testé l’expression cellulaire de Ki67 (un marqueur de prolifération cellulaire) et de la caspase active (caspase 3, l’effecteur final de l’apoptose). Les résultats ont révélé que dans les cellules cancéreuses, 10 µM d’UM0112176 (24 h de traitement) diminuait fortement le signal fluorescent lié au Ki67 (Fig. 1c) et augmentait la présence de la caspase active (Fig. 1d). Dans les cellules normales, aucun changement n’a été observé (Fig. 1d) même après 48 h de traitement (Fig. S2a supplémentaire).

Le traitement par UM0112176 perturbe le cytosquelette d’actine et modifie les taux de ROS, de potentiel de membrane mitochondrial, de Ca2+, de DSB et d’ATP dans les cellules cancéreuses mais pas dans les cellules normales

Pour élucider le mécanisme d’action d’UM0112176, nous avons examiné un certain nombre d’activités cellulaires potentiellement influencées par l’inhibiteur, notamment la morphologie du cytosquelette, la concentration en ATP, les niveaux d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), le potentiel de la membrane mitochondriale et les cassures double brin de l’ADN (DSB). La manifestation la plus prononcée de l’action de l’inhibiteur a été la disparition complète des fibres de stress de la F-actine dans les cellules cancéreuses, mais pas dans les cellules normales, après 24 heures d’incubation avec l’inhibiteur (Fig. 1e). Fait intriguant, le début de la perturbation de l’actine polymérique était beaucoup plus rapide (<5 min) (figure supplémentaire S3a) que l’inhibition complète de l’ALDOA in vitro (∼15 min). Ceci soutient l’hypothèse selon laquelle la dépolymérisation de la F-actine ne dépend pas de l’inhibition de l’activité de l’ALDOA.

En même temps que la perturbation du cytosquelette, nous avons observé une élévation significative des taux de ROS et de calcium, une diminution de la concentration d’ATP et du potentiel de la membrane mitochondriale, ainsi que l’induction de cassures double brin de l’ADN (Fig. 2a-e). Il est important de noter que les changements induits par l’UM0112176 dans les cellules cancéreuses n’ont pas été transmis (par exemple, par la libération de ROS) aux cellules normales : Le traitement par l’UM0112176 des cellules KLN205 co-cultivées avec des fibroblastes humains normaux a augmenté les niveaux de ROS uniquement dans les cellules cancéreuses (figure supplémentaire S3b).

Les changements induits par l’UM0112176 ne peuvent pas être expliqués par l’inhibition de la glycolyse

Afin de déterminer plus précisément si les changements induits par l’UM0112176 peuvent être reproduits par l’inhibition de la glycolyse dans les cellules cancéreuses, nous avons testé l’impact d’autres effecteurs d’enzymes glycolytiques : le rouge d’alizarine S qui inhibe la phosphoglycérate mutase (PGAM)18 et le 3-PO ((2E)-3-(3-pyridinyl)-1-(4-pyridinyl)-2-propen-1-one) qui bloque indirectement l’action de la 6-phosphofructo-2-kinase/fructose-bisphosphatase-2 (PFK-2)19. L’inhibition de la PGAM a entraîné une augmentation des ROS (figure supplémentaire S4a) sans avoir d’effet sur le niveau de calcium cytoplasmique, tandis que l’inhibition de la PFK-2 a augmenté les niveaux de Ca2+ cytoplasmique sans modification des ROS (figure supplémentaire S4a, b). De plus, même les cellules cancéreuses à prolifération rapide (KLN205) ont pu maintenir un niveau constant d’ATP total (Fig. S4c, d) en présence de ces inhibiteurs, utilisant probablement d’autres nutriments tels que la glutamine plutôt que d’activer l’absorption du glucose. Il est important de noter que ni le 3-PO ni le rouge d’alizarine S n’ont perturbé le cytosquelette de F-actine ou induit des DSBs (données non présentées).

UM0112176 perturbe les interactions ALDOA-actine

L’aldolase est connue pour interagir avec l’actine et les protéines de liaison à l’actine8,9, influençant la dynamique du cytosquelette. Elle peut inhiber la polymérisation de l’actine dépendante de WASP14 et entraîner un défaut de cytokinèse20, mais elle peut également favoriser les processus dépendants de l’actine tels que la motilité des cellules cancéreuses acquises lors de la transition EMT21. Ce rôle complexe de l’ALDOA évoque l’hypothèse selon laquelle la liaison d’UM0112176 à l’ALDOA pourrait être responsable de la perturbation observée du cytosquelette de F-actine.

La perturbation du cytosquelette est cependant spécifique à l’isoforme d’actine puisque UM0112176 a partiellement perturbé l’association de l’ALDOA avec la forme fibrillaire de l’actine cytosquelettique contenant les isoformes β et γ (figure 3a) tout en n’ayant aucun effet sur la stabilité des polymères d’actine musculaire (isomère α) (données non présentées). Dans les radeaux F-actine-aldolase, les contacts de la F-actine avec l’aldolase se trouvent principalement dans deux loci ; la région des résidus 1-8 et les résidus 350-36522. Des sondes antigéniques ont localisé des sites de liaison étroite pour l’aldolase dans les régions C-terminales conservées des microfilaments d’α-actine23. Une simulation de dynamique brownienne a trouvé des résidus d’actine similaires qui participent à la liaison de l’aldolase24. Comme les différences entre les résidus 1 à 8 distinguent les isoformes d’actine25, la région N-terminale de l’actine dirige donc la liaison isoforme-spécifique avec l’aldolase. Il a également été démontré que l’ALDOA interagit préférentiellement avec l’actine γ dans des pulldowns cellulaires de lysats de cellules de cancer du poumon26 corroborant le fait que le contact de l’ALDOA avec la région N-terminale de l’actine distingue les isoformes d’actine.

Intéressant, le site de liaison de l’ALDOA chevauche le site de liaison de la cofiline sur l’actine27,28, une protéine connue pour accélérer la dépolymérisation des fibres d’actine29, dont la liaison implique le chevauchement des résidus d’actine N- et C-terminaux30. Étant donné les grandes formes globulaires de l’ALDOA et de la cofiline, le chevauchement apparent important des sites de liaison à l’actine indique une compétition entre l’ALDOA et la cofiline pour les mêmes loci de liaison sur l’actine. L’incubation de la F-actine (isoformes β-γ) avec l’ALDOA et la cofiline (en concentrations équimolaires de sous-unités) a montré un faible effet de la cofiline sur la stabilité de la F-actine (Fig. 3b), ce qui indique que l’ALDOA protège la F-actine contre l’action de la cofiline. Ceci est cohérent avec la liaison attendue plus étroite de l’ALDOA à la F-actine23 que la cofiline qui a une constante de dissociation estimée à ∼10 μM31. La protection in vitro par ALDOA contre la dépolymérisation de l’actine médiée par la cofiline a été abolie par l’ajout d’UM0112176 (figure 3b). Bien que l’ALDOA puisse interagir avec la cofiline in vitro, nous n’avons trouvé aucune preuve que l’UM0112176 perturbe cette interaction (Fig. S2b supplémentaire). La déstabilisation du cytosquelette de F-actine par UM0112176 doit donc provenir de la dissociation d’ALDOA de ses loci de liaison sur la F-actine qui chevauchent les loci de liaison de la cofiline, permettant ainsi la fixation de la cofiline à la F-actine et la médiation de sa dépolymérisation. En accord avec cela, nous avons observé l’absence de colocalisation de l’actine cytosquelettique et de l’ALDOA dans les cellules KLN205 traitées avec UM0112176 (Fig. 3c).

Pour étudier l’interaction d’UM0112176 avec l’ALDOA (PDB : 1ZAJ), une analyse de docking moléculaire en aveugle a été réalisée. Les calculs effectués à l’aide d’AutoDock32 ont indiqué 1 cluster de poses majeur et 2 clusters de poses mineurs pour UM0112176 sur ALDOA. Le cluster majeur contenait 17 poses avec une énergie de liaison prédite proche de ∼9,2 kcal/mole tandis que le cluster mineur avait chacun 3 poses d’énergie de liaison légèrement inférieure. Une inspection visuelle place la pose supérieure à proximité de Lys-293 et de Cys-338 (Fig. 3d), permettant à leurs rotamères de se lier par hydrogène, respectivement avec les groupes fonctionnels -C≡N et -Cl de UM0112176. La modification de Cys-72 et Cys-338, soit par leur réticulation33, soit par le glutathion oxydé, inhibe l’activité catalytique34 par une communication à longue distance avec le site actif distant de ~25Å. L’inhibition à distance des événements dynamiques au cours de la catalyse nécessaire à l’activité de l’ALDOA par UM0112176, comme cela a été montré pour l’inactivation de l’ALDOA par le glutathion oxydé34, est cohérente avec sa cinétique d’inhibition. De manière intrigante, il a été démontré que la Lys-293 favorise l’interaction de la γ-actine avec l’ALDOA, la mutation K293A abrogeant la liaison26. De plus, les résidus comprenant la cavité de liaison d’UM0112176 chevauchent ceux montrés pour le raltégravir sur l’ALDOA et le traitement avec le raltégravir (100 μM) a prolongé le taux de survie des souris ∼2 fois par rapport au groupe témoin26 dans un modèle de cancer du poumon orthotopique. Nous émettons l’hypothèse que UM0112176 tire parti de la capacité à dissocier l’ALDOA de la β/γ actine en entrant en compétition avec la γ-actine pour l’interaction avec la Lys-293 sur l’ALDOA.

Cette constatation n’explique cependant pas l’absence d’action d’UM0112176 sur l’actine cytosquelettique dans les cellules normales. De toute évidence, dans les cellules normales, d’autres protéines associées à l’actine doivent protéger le cytosquelette contre la dépolymérisation induite par la cofiline, mais dans les cellules cancéreuses, cette protection est apparemment défectueuse. Nous avons donc cherché des facteurs spécifiques au cancer qui pourraient accélérer la dépolymérisation du cytosquelette de F-actine et qui seraient capables d’induire l’apoptose. Nous avons constaté que l’un des principaux effets cellulaires de l’application d’UM0112176 était une intensification très rapide de la production de ROS, qui se produisait exclusivement dans les cellules cancéreuses (Fig. 2a). Comme l’augmentation des niveaux de ROS était concomitante avec la modulation de la structure des fibres de F-actine35, nous nous sommes concentrés sur les sources de ROS associées au cytosquelette qui peuvent être spécifiques aux cellules cancéreuses.

L’augmentation des niveaux de ROS après le traitement par UM0112176 est causée principalement par l’activité NOX

L’oxydase dépendante du NADPH (NOX) est une source importante de ROS intracellulaire qui peut être régulée par le cytosquelette d’actine36. Il a été démontré que NOX1 participe à la transition épithélio-mésenchymateuse, un processus facilitant l’invasion des cellules cancéreuses37. Nous avons donc émis l’hypothèse que le déplacement de l’ALDOA de l’actine polymérisée induit par UM0112176 permettait la déstabilisation du cytosquelette par la cofiline et que la dépolymérisation qui s’ensuivait pouvait être responsable de l’augmentation des ROS. Il est intéressant de noter que dans la plupart des cellules cancéreuses, les protéines NOX (en particulier l’isoforme NOX1) sont exprimées à un niveau plus élevé que dans les cellules normales38 (figure supplémentaire S2c). Nous avons donc réduit au silence l’expression de NOX1 dans les cellules cancéreuses (Fig. 3h) ou inhibé l’activité de NOX1 en utilisant l’apocynine39. La réduction résultante de l’activité et de l’expression de NOX1 a bloqué l’élévation des niveaux de ROS induite par UM0112176 (Fig. 3e-g).

Ce mécanisme de production de ROS dépendant de l’actine suggère que UM0112176, en stimulant le déplacement d’ALDOA à partir des filaments d’actine, permet à la cofiline de dépolymériser les filaments d’actine et ainsi, d’activer NOX. La production de ROS par NOX activé, à son tour, permet l’activation redox de slingshot homolog 1 pour déphosphoryler la P-cofiline40. En effet, l’ajout d’UM0112176 a réduit les niveaux cellulaires de P-cofiline (figure supplémentaire S5a). L’ALDOA dissocié des filaments d’actine par l’action de l’UM0112176 favorise leur dépolymérisation ultérieure en libérant des sites de liaison supplémentaires pour que la cofiline déphosphorylée puisse se lier aux filaments. Ce mécanisme de feed-forward expliquerait la dépolymérisation rapide de l’actine observée dans les cellules KLN205 et hNSCLC.

Surprenant, l’apocynine n’a que partiellement arrêté l’augmentation du niveau de calcium cytoplasmique induite par UM0112176 et elle n’a pas protégé contre l’activation de la caspase 3 (Fig. 3i, j). Bien que l’apocynine ait apparemment inhibé la perturbation des filaments d’actine par UM0112176, le cytosquelette est apparu plus enchevêtré par rapport aux cellules non traitées, et les cellules ont présenté une morphologie altérée lorsqu’elles ont été traitées simultanément par l’apocynine et UM0112176 (Fig. 3k). La perturbation du cytosquelette par UM0112176 ou en combinaison avec l’apocynine est cohérente avec la production de ROS dépendante de NOX1 pour une organisation adéquate du cytosquelette dans ces cellules cancéreuses.

Le mécanisme cellulaire d’action de l’UM0112176 implique l’ouverture de mitoKATP

Une protéine qui pourrait potentiellement relier le cytosquelette d’actine avec la production de ROS mitochondriaux et l’apoptose est le canal potassique mitochondrial ATP-dépendant (mitoKATP). Un lien entre la concentration intracellulaire de K+ et l’apoptose a été documenté dans de nombreux systèmes et a impliqué mitoKATP41. Le canal semble être sensible à la dépolymérisation de l’actine qui augmente son ouverture42,43 et entraîne un léger découplage et une augmentation de la production de ROS mitochondriaux44. Il existe cependant une controverse dans la littérature, certains résultats suggérant plutôt que la perturbation de l’actine ferme le mitoKATP45.

Nous avons prétraité les cellules cancéreuses avec du 5HD (5-Hydroxydécanoate), connu pour bloquer l’ouverture du mitoKATP44, et nous avons observé que le 5HD diminuait considérablement l’augmentation des ROS induite par UM0112176 (Fig. 4a). Le prétraitement par la 5HD n’a pas été capable de bloquer la perturbation du cytosquelette d’actine (Fig. 4b) et l’induction de l’apoptose par l’UM0112176, bien qu’il ait considérablement ralenti le taux d’activation de la caspase 3 (Fig. 4c). Ainsi, la dépolymérisation de l’actine cytosquelettique induite par l’UM0112176 peut être responsable de la production de ROS à la fois par l’ouverture de la mitoKATP et, indépendamment, par l’activation de NOX1 qui, à son tour, potentialise la perturbation du cytosquelette.

Le mode inverse de l’échangeur sodium-calcium est responsable de l’influx calcique induit par UM0112176

La liaison d’UM0112176 à l’ALDOA était également associée à une augmentation significative du taux de calcium cellulaire dans les cellules cancéreuses mais pas dans les cellules normales (Fig. 2b). Cette augmentation était plus rapide dans les cellules KLN205 (<5 min) que dans les cellules hNSCLC (~20 min) (Fig. S4g). Nous avons donc cherché l’origine de ce calcium et avons trouvé qu’il provenait du stock extracellulaire (Fig. 4d, e). La déplétion en Ca2+ du milieu de culture a empêché l’augmentation du calcium cellulaire induite par UM0112176.

Nous avons ensuite demandé si NOX1 et la mitoKATP pouvaient réguler de manière synergique les changements du niveau de Ca2+ libre intracellulaire. En effet, l’inhibition de NOX1 a partiellement protégé contre l’augmentation du Ca2+ induite par UM0112176 (Fig. 3i), tandis que l’inhibition de l’ouverture de la mitoKATP a pratiquement aboli cette augmentation (Fig. 4f, g). Comme aucune des deux protéines ne fonctionne comme un canal ou un échangeur de calcium, elles doivent fonctionner comme des régulateurs (par exemple, via les ROS) des protéines directement impliquées dans l’homéostasie du calcium.

L’activation de NOX peut conduire à l’ouverture de la mitoKATP qui, à son tour, peut indirectement stimuler le mode inverse de l’échangeur sodium-calcium (NCXrev), favorisant l’afflux de Ca2+ dans les cellules46. Ainsi, nous avons testé une possible implication de NCX dans l’augmentation du calcium induite par UM0112176. En effet, l’inhibition de la NCXrev par le KB-R794346 a réduit l’influx de calcium (Fig. 4h). Cependant, cela n’a pas empêché l’induction de l’apoptose (Fig. S5b supplémentaire).

Il a été montré que la dépolymérisation de l’actine stimule l’activité du NCXrev47, ce qui apporte un soutien supplémentaire au NCX comme échangeur responsable de l’influx de Ca2+ lors de l’ajout d’UM0112176.

On peut donc conclure que la diaphonie entre NOX et ROS mitochondriaux48 active les transporteurs membranaires, l’échangeur sodium/hydrogène et le cotransporteur sodium/bicarbonate via la stimulation de la cascade MAPK sensible aux ROS et aboutit à l’influx de Ca2+ via NCXrev49. En outre, la surcharge cytoplasmique en Ca2+ active NOX50 et la charge mitochondriale en Ca2+ via l’uniporteur de calcium mitochondrial accélère la production mitochondriale de ROS51, créant ainsi une boucle de rétroaction positive qui maintient des niveaux élevés de ROS et de calcium et induit l’apoptose. La suppression de l’influx de Ca2+ par l’inhibition de la NCXrev (Fig. 4h) soutient l’idée que l’ouverture de la mitoKATP conduisant à la libération de ROS mitochondriaux dans le cytoplasme52 constitue l’événement crucial responsable de l’apoptose.

La diminution spécifique aux cellules cancéreuses des niveaux d’ATP lors de l’inhibition de l’ALDOA induit une dissociation rapide de HK2 des mitochondries

Bien que l’UM0112176 ait inhibé la synthèse d’ATP dans toutes les lignées cellulaires, les changements d’ATP étaient plus importants et plus rapides dans les cellules cancéreuses (Fig. 2c). Il est important de noter que dans les cellules normales, mais pas dans les cellules cancéreuses, ces changements étaient réversibles après le retrait de l’inhibiteur (figure supplémentaire S4e). L’ajout d’UM0112176 a induit un déclin rapide (<5 min) des niveaux d’ATP dans les cellules KLN205 (∼40% de déclin) et hNSCLC (∼20% de déclin) (Supplementary Fig. S4f) alors qu’aucun changement de ce type n’a été observé dans les cellules normales (Supplementary Fig. S4f).

Cette cinétique biphasique de la déplétion en ATP induite par UM0112176 a soulevé la question du mécanisme responsable de la diminution rapide des niveaux d’ATP dans les cellules cancéreuses. Nous avons donc examiné la localisation subcellulaire de l’hexokinase 2 (HK2) dont l’expression est élevée dans la plupart des cellules cancéreuses et qui doit être associée aux mitochondries pour être pleinement active et permettre une synthèse efficace de l’ATP par les mitochondries4,5. Nous avons observé que dans les cellules cancéreuses, mais pas dans les cellules normales, la HK2 se dissocie rapidement des mitochondries après le traitement par UM0112176 (Fig. 4i) et que la durée de ces changements est corrélée à la durée de la production de ROS. Ainsi, dans les cellules cancéreuses en prolifération rapide, la première phase de la diminution des niveaux d’ATP dépendante de l’UM0112176 est corrélée à la dissociation rapide de HK2 des mitochondries.

La mise sous silence de l’expression d’ALDOA (Fig. S5c supplémentaire) a récapitulé les observations induites par le traitement UM0112176 (Fig. S5d-f supplémentaire) et n’a montré aucune diminution concomitante des niveaux d’ATP, en accord avec les résultats rapportés par Lew et Tolan14,20. Cela indique que la diminution observée des niveaux d’ATP n’est pas une conséquence d’une activité métabolique plus faible, mais qu’elle provient des interactions de l’ALDOA avec ses partenaires de liaison qui sont abrogées par l’UM0112176. Chang et al. ont souligné que la mutation K293A de l’ALDOA influence l’interaction de l’ALDOA avec la γ-actine mais n’entraîne pas de modifications du flux glycolytique26 soutenant notre interprétation selon laquelle UM0112176 interfère avec les interactions  » moonlighting  » de l’ALDOA.

L’effet de l’UM0112176 sur les cellules cancéreuses ne peut pas être expliqué par l’accumulation de FBP

Pour vérifier si les changements observés sont associés à une fonction non métabolique de l’ALDOA ou s’ils sont des conséquences de l’inhibition de l’activité enzymatique et donc de l’accumulation de FBP, nous avons examiné l’effet du FBP sur le niveau de ROS et d’ATP ainsi que sur la structure du cytosquelette. Bien que l’efficacité de la diffusion transmembranaire de la FBP soit relativement faible, elle peut être activement et efficacement transportée par diverses cellules53,54. Nous avons observé que 20 mM mais pas 5 mM de FBP extracellulaire stimulaient la production de ROS et déstabilisaient la structure du cytosquelette dans les cellules cancéreuses (figure supplémentaire S3c, d), ce qui est cohérent avec la communication à longue distance entre le site actif de l’aldolase et le locus de liaison UM0112176. Les mêmes concentrations de FBP n’ont eu qu’un effet mineur sur les cellules normales (figure supplémentaire S3c, d), reflétant la tendance observée pour le traitement cellulaire avec UM0112176. L’absence de changements perceptibles dans les astrocytes concorde avec la quasi-absence de NOX1 dans ces cellules (figure supplémentaire S2c) et renforce l’importance de la production de ROS par NOX1 dans les cellules cancéreuses pour une organisation correcte du cytosquelette. Bien que la présence de faibles niveaux de NOX1 dans les cellules normales qui ne subissent pas d’apoptose lorsqu’elles sont traitées par UM0112176 puisse s’opposer à ce que NOX1 confère une sélectivité aux cellules cancéreuses pendant le traitement par UM0112176, il a été démontré que les milieux de culture à faible teneur en glucose (5 mM) empêchent l’isoforme NOX4 de se diriger vers les radeaux lipidiques dans les adipocytes en la maintenant dans une fraction membranaire à faible activité55. Comme nos expériences de culture cellulaire ont été menées en utilisant des concentrations de glucose qui modélisent l’environnement physiologique (5 mM), la présence de NOX1 dans les cellules normales sert probablement une autre fonction non cytosquelettique.

UM0112176 empêche la localisation nucléaire de l’ALDOA

De manière inattendue, le traitement par UM0112176 a également entraîné la déplétion de l’ALDOA des noyaux des cellules cancéreuses (figure supplémentaire S5g). Il a été démontré que la localisation nucléaire de l’ALDOA est associée à la progression du cycle cellulaire17, cependant, le mécanisme de transport nucléaire de l’ALDOA et son importance pour la régulation du cycle cellulaire nécessitent des études supplémentaires.

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