La taille et la densité des stomates du blé changent avec la ploïdie
Pour déterminer si les caractéristiques stomatiques varient avec le niveau de ploïdie chez le blé, nous avons examiné la taille et la configuration des stomates chez deux espèces diploïdes (2n) (Triticum baeoticum et T. urartu), deux espèces tétraploïdes (4n) (T. araraticum, T. dicoccoides) et trois cultivars de l’espèce hexaploïde (6n) T. aestivum (cv. Cougar, Crusoe et Shango). Les espèces de blé présentent des stomates caractéristiques des graminées, les complexes stomatiques (chacun composé d’une paire de cellules de garde flanquées de cellules subsidiaires) se trouvant dans des files de cellules épidermiques le long de la surface de la feuille. Des exemples d’images montrant la distribution générale des stomates dans les différents fonds de ploïdie sont présentés dans la Fig. 1a-c, avec des images à plus haute résolution des complexes stomatiques individuels présentés dans la Fig. 1d-f. Ces images suggèrent que la taille et la densité des stomates des feuilles sont influencées par la ploïdie chez le blé. La mesure de ces paramètres suivie d’une analyse statistique (ANOVA avec Tukey posthoc) a montré que les complexes stomatiques des cultivars hexaploïdes étaient plus larges que ceux des espèces tétraploïdes (P < 0,001) et diploïdes (P < 0,001), qui étaient eux-mêmes indiscernables (P = 0,115 ; Fig. 1g). En revanche, la longueur des complexes stomatiques était indiscernable entre les lignées tétraploïdes et hexaploïdes (ANOVA avec Tukey posthoc, P = 0.479), alors que les stomates étaient significativement plus courts dans les blés diploïdes que dans les lignées tétraploïdes (P < 0,001) et hexaploïdes (P < 0,001 ; Fig. 1i). Ainsi, puisque la surface du complexe stomatique dépend à la fois de la longueur et de la largeur des stomates, les différences progressives de ces paramètres entre les trois milieux de ploïdie conduisent à ce que la taille des stomates soit distincte à chaque niveau de ploïdie (ANOVA avec Tukey posthoc, diploïde/tétraploïde P < 0.001 ; tétraploïde/hexaploïde P < 0,001). Les complexes stomatiques étaient les plus petits chez les espèces diploïdes, les plus grands chez les cultivars hexaploïdes et intermédiaires chez les espèces tétraploïdes (Fig. 1h). L’augmentation progressive de la longueur des complexes stomatiques montrée dans la Fig. 1i a été reflétée par la densité stomatique (Fig. 1j), avec les espèces diploïdes ayant des densités nettement plus élevées que celles observées chez les espèces tétraploïdes (ANOVA avec Tukey posthoc, P < 0.001) et les espèces hexaploïdes (P < 0,001) (qui n’ont pas pu être distinguées les unes des autres sur la base de la densité stomatique ; P = 0,616). Nos données suggèrent qu’il y a eu une sélection indirecte pour des feuilles avec des stomates plus grands mais relativement moins nombreux pendant la domestication complexe du blé hexaploïde moderne. Cela semble s’être produit de manière progressive, de sorte que les tétraploïdes se distinguent des diploïdes par des stomates plus longs et moins denses de largeur similaire, et que les cultivars de blé panifiable modernes hexaploïdes présentent des complexes stomatiques plus larges que leurs parents sauvages tétraploïdes, ce qui s’est probablement produit après ou en même temps que la fusion des progéniteurs diploïdes et tétraploïdes.
La configuration stomatique change avec le niveau de ploïdie chez le blé. Images échantillons de la distribution stomatique globale le long de l’épiderme adaxial (a-c) et des complexes stomatiques individuels (d-f) chez Triticum baeoticum (2n ; a, d), T. araraticum (4n ; b, e) et T. aestivum cv Cougar (6n ; c, f). Barre d’échelle a-c = 80 µm ; d-f = 20 µm. Largeur stomatique (g) (ANOVA, F(2,81) = 169,5, P < 0,0001), surface (h) (ANOVA, F(2,81) = 218,7, P < 0,0001), longueur (i) (ANOVA, F(2,73) = 80.29 p < 0,0001), la densité (j) (ANOVA, F(2,81) = 61,21 P < 0,0001) et la conductance, gs (k) (ANOVA, F(2,25) = 7,494, P = 0,0028) sont présentées pour toutes les lignées de blé analysées. Les résultats d’un test posthoc de Tukey comparant les niveaux de ploïdie séquentiels sont indiqués dans chaque analyse, avec un astérisque lorsqu’il est significatif au niveau p < 0,05 ou NS lorsqu’il n’est pas significatif. Pour g-k, les données sont présentées sous forme de diagrammes en boîte (25e-75e percentile, ligne horizontale = médiane) avec des moustaches indiquant les valeurs maximales et minimales, n = 6. l Pour chaque lignée de blé analysée, la porosité mésophile moyenne est représentée en fonction de la conductance stomatique moyenne, gs, avec le niveau de ploïdie indiqué pour chaque point. Les résultats de l’analyse de corrélation sont présentés (valeur r2 de Pearson). Les résultats pour les données individuelles appariées sont présentés dans la figure supplémentaire. 2
L’espace aérien mésophile et la structuration des stomates sont coordonnés
Pour étudier les relations potentielles entre la variation observée des caractéristiques stomatiques et la structuration du mésophylle, nous avons utilisé l’analyse d’images microCT à haute résolution pour quantifier la porosité et la surface du mésophylle dans les mêmes lignées de blé utilisées pour la caractérisation stomatique ci-dessus. Des exemples d’images de T. urartu, T. araraticum et T. aestivum cv Cougar sont présentés à la Fig. 2 sous forme de reconstructions 3D de segments de feuilles (Fig. 2a-c), avec des exemples de sections transversales (Fig. 2d-f), longitudinales (Fig. 2g-i) et paradermiques (Fig. 2j-l) dans lesquelles l’espace aérien est représenté en jaune et le matériel cellulaire en vert. Des images équivalentes pour les autres lignées de blé analysées sont présentées dans la figure supplémentaire 1. Ces vues montrent que toutes les feuilles de blé présentent une anatomie classique de feuille de graminée, consistant en des nervures parallèles le long de l’axe longitudinal de la feuille formant des limites pour le tissu mésophylle. La séparation cellulaire au sein du tissu mésophylle forme un motif très régulier d’espace aérien qui est clairement mis en évidence dans les vues longitudinales et paradermiques (Fig. 2g-l), tandis que les sections présentées dans les Fig. 2j-l fournissent une indication des différences dans la taille, la distribution et la quantité globale d’espace aérien entre les espèces de blé. La microtomographie permet de quantifier ces différences, non pas simplement sur des coupes en 2D mais sur toute la profondeur du tissu en 3D. L’analyse de la porosité des tissus (c’est-à-dire le volume de l’espace aérien par rapport au volume total des tissus) de la surface adaxiale (supérieure) à la surface abaxiale (inférieure) des feuilles a révélé des similitudes et des différences dans la quantité et la distribution de l’espace aérien. Toutes les espèces ont montré un modèle d’augmentation de la porosité en s’éloignant de l’épiderme, avec un plateau de porosité relativement élevé dans la partie centrale de la feuille (Fig. 2m-o). Le taux d’augmentation de la porosité avec la distance dans la feuille était le plus élevé pour les espèces diploïdes (Fig. 2m), les espèces hexaploïdes montrant un gradient de porosité plus faible (Fig. 2o) et, généralement, une valeur de porosité maximale plus faible que celle observée chez les espèces diploïdes. Les espèces tétraploïdes ont montré des modèles intermédiaires de porosité sur toute la profondeur de la feuille (Fig. 2n). Dans l’ensemble, notre analyse des paramètres structurels à travers les feuilles de blé de différentes ploïdies suggère que, bien que le modèle de base de l’espace aérien et de la distribution des tissus dans la feuille ait été conservé au cours de l’évolution du blé hexaploïde à partir des parents sauvages diploïdes et tétraploïdes, il y a eu une sélection, directe ou indirecte, pour une structure foliaire avec une porosité plus faible (c’est-à-dire, mésophylle plus dense).
L’imagerie microCT révèle une variation de l’espace aérien des feuilles de blé avec la ploïdie. Images d’échantillons de feuilles de Triticum urartu (2n), T. araraticum (4n) et T. aestivum cv Cougar (6n) dans des rendus 3D de blocs de tissus (a-c), de sections transversales (d-f), de sections longitudinales (g-i) et de sections paradermiques (j-l), avec les tissus solides en vert et l’espace aérien en jaune. La porosité du mésophylle (%) (m-o) est tracée le long de la profondeur de la feuille, des surfaces adaxiales aux surfaces abaxiales, dans les lignées diploïde (m), tétraploïde (n) et hexaploïde (o), comme indiqué. T. baoeticum – bleu foncé ; T. urartu – bleu clair ; T. dicoccoides – orange foncé ; T. araraticum – orange clair ; T. aestivum (Crusoe) – vert foncé ; T. aestivum (Cougar) – vert moyen ; T. aestivum (Shango) – vert clair. Pour plus de clarté, seules les valeurs moyennes de 6 échantillons répétés sont présentées dans les panneaux m-o. Les lignes en a-c indiquent le plan de la section en g-i, respectivement, également indiqué par les lignes verticales en j-l. Les lignes horizontales en j-l indiquent le plan de coupe pour d-f, respectivement. Résolution de l’image = 2,75 µm. Barres d’échelle a-l = 200 µm
L’échange gazeux reflète l’espace aérien et le patronage stomatique
En utilisant la diversité représentée dans ces parents de blé, nous avons procédé à l’étude des effets des tendances observées en matière de taille/densité stomatique et d’espace aérien mésophile sur les échanges gazeux, via des mesures de la conductance stomatique à la vapeur d’eau (gs) et des estimations de la conductance stomatique maximale (gsmax). Ces données ont révélé une corrélation positive frappante entre la porosité du mésophylle et la gs (r2 = 0,915, P = 0,0007 ; Fig. 1l), les espèces diploïdes présentant une gs élevée et une porosité élevée et les feuilles hexaploïdes une gs faible et une porosité faible (Fig. 1k). Cette forte corrélation entre la porosité du mésophylle et la gs s’est maintenue lorsque les données individuelles de plantes répétées par paires pour les différentes lignées analysées ont été prises en compte (corrélation de Pearson, r2 = 0,451, P = 0,0001 ; Fig. 2 supplémentaire). La diminution de la porosité associée à l’augmentation du niveau de ploïdie a également été liée à une diminution de la surface mésophile exposée par volume de tissu, ce qui a entraîné une forte corrélation positive de gs et de ce paramètre (corrélation de Pearson, r2 = 0,718, P = 0,016 ; figure supplémentaire 3a), qui a également été observée lorsque la surface mésophile exposée a été exprimée par surface foliaire (corrélation de Pearson, r2 = 0,633, P = 0,0323 ; figure supplémentaire 3b). La relation entre gsmax (calculée à partir des mesures indiquées dans la figure supplémentaire 3e) et la porosité était moins forte (corrélation de Pearson, r2 = 0,487, P = 0,081 ; figure supplémentaire 3c) que celle observée avec gs (figure 1l). L’analyse de gsmax et de la surface stomatique a révélé une corrélation inverse (corrélation de Pearson, r2 = 0,613, P = 0,037) (figure supplémentaire 3d), ce qui est conforme aux travaux antérieurs indiquant un compromis complexe entre la taille et la densité des stomates sur gs, les feuilles présentant une forte densité de petits stomates transmettant plus de gs par surface stomatique que les feuilles présentant une faible densité de grands stomates20,21. Dans l’ensemble, notre analyse de gs, de la porosité du mésophylle et de la surface exposée est cohérente avec l’hypothèse selon laquelle une plus grande surface exposée du mésophylle et l’allocation d’un volume de tissu à l’espace aérien facilitent une diffusion gazeuse accrue vers et depuis le mésophylle.
La relation entre les stomates et l’espace aérien du mésophylle
Les analyses présentées ci-dessus sont cohérentes avec, mais ne prouvent pas, une relation causale entre la différenciation stomatique et la formation de l’espace aérien du mésophylle. Pour tester cette hypothèse, nous avons utilisé une série de lignées transgéniques de blé dont les propriétés stomatiques sont modifiées. Des preuves significatives montrent que le modelage stomatique est contrôlé par une série de signaux peptidiques mobiles, les Epidermal Patterning Factors (EPFs)22,23,24, qui fournissent des outils efficaces pour modifier la densité stomatique et, ainsi, étudier le résultat sur la différenciation du mésophylle7. La surexpression de l’EPF1 ou son proche parent EPF2 dans Arabidopsis a été montré pour conduire à une diminution de la densité stomatique25 et la surexpression d’un gène cognate dans le blé (TaEPF1) a récemment été montré pour conduire à un phénotype similaire26.
L’imagerie confocale des lignées TaEPF1-OE a révélé que certaines cellules dans les fichiers épidermiques de formation de stomates semblent avoir subi les événements initiaux de la formation de stomates, mais n’ont pas réussi à subir le processus de division finale pour générer le complexe stomatique et le pore (Fig. 3a). Les cellules mésophylliennes directement sous-jacentes à ces progéniteurs stomatiques anormaux ne montrent aucun signe de séparation cellulaire, alors que les stomates matures présentent des cavités sous-stomatiques claires (Fig. 3b, c). Le comptage de la présence/absence de cavités sous-stomatales a confirmé l’absence totale de cavités d’espace aérien sous les cellules de la lignée stomatique avortée dans les lignées de blé TaEPF1-OE, alors que tous les stomates différenciés étaient sous-tendus par des cavités (Fig. 3h). L’imagerie microCT des feuilles TaEPF1-OE a également révélé l’absence de cavités sous-stomatiques par rapport à la lignée WT (Fig. 3d, e) et un mésophylle plus dense (Fig. 3f, g). La quantification de la structure foliaire a révélé que les feuilles TaEPF1-OE avaient effectivement une porosité inférieure à celle des feuilles WT (Fig. 3i). Les mesures des échanges gazeux ont révélé une diminution significative de gs dans les lignées TaEPF1-OE par rapport aux feuilles témoins non transgéniques (Fig. 3j).
La surexpression de l’EPF arrête le développement de la cavité sous-stomatique et diminue la porosité du mésophylle dans le blé. a Vue d’ensemble confocale d’une feuille de blé TaEPF1 OE montrant la couche épidermique (violet), les cellules mésophylles sous-jacentes (vert), un stomate (St) composé de cellules de garde et de cellules subsidiaires associées et, dans le même dossier, un précurseur stomatique arrêté (Ap). Barre d’échelle = 60 µm. b, c Images à plus haute résolution de (b) le stomate et (c) la cellule précurseur stomatique arrêtée montrée en a. Barres d’échelle = 40 µm. d-g Images microCT d’une feuille de type sauvage (WT) (d, f) et d’une feuille TaEPF1 OE (e, g) dans un plan paradermal à l’intérieur du mésophylle directement sous l’épiderme (d, e) ou plus profondément dans la feuille (f, g), avec le tissu solide en vert et l’espace aérien en jaune. Les espaces d’air plus grands en d, e indiquent les cavités sub-stomatales. Notez que les cavités sub-stomatales sont moins nombreuses dans la feuille TaEPF1 OE. Barres d’échelle = 100 µm. h-j Dans le blé WT et deux lignées indépendantes de blé transgénique surexprimant TaEPF1 (comme indiqué), (h) la densité des stomates (n = 87), des cavités sub-stomatiques (n = 87) et des cellules précurseurs de stomates arrêtées (n = 52 de 5 feuilles indépendantes) ; (i) la porosité du mésophylle telle que mesurée par analyse microCT (ANOVA, F(2,12) = 4.977, p = 0,027) ; et (j) la conductance stomatique, gs, sont indiquées (ANOVA, F(2,12) = 46,86, p < 0,0001). Pour i et j, une analyse posthoc Tukey a été réalisée (n = 5). Les lignes partageant la même lettre sont indiscernables les unes des autres à la limite de confiance p < 0,05. Les données (h-j) sont présentées sous forme de box plots (25e-75e percentile, ligne horizontale = médiane) avec des moustaches indiquant les valeurs maximales et minimales
Pour approfondir le lien potentiel entre la séparation cellulaire sous-épidermique et les événements de la différenciation stomatique, nous avons exploité le fait que l’axe longitudinal d’une feuille de graminée fournit un gradient de développement de la différenciation des tissus, avec des cellules à la base proximale subissant une division pour générer des cellules qui entrent dans un certain nombre de voies de développement, y compris la formation de stomates, dans les régions de pointe plus distales23. L’analyse de la lignée témoin (le parent non transformé des plantes transgéniques TaEPF1-OE) n’a révélé aucun gradient de densité stomatique dans les régions observées à l’extrémité, au milieu ou à la base de la feuille mature 5 (figure supplémentaire 4a). Cependant, une analyse similaire de feuilles comparables des lignées transgéniques TaEPF1-OE a indiqué une diminution de la densité stomatique à la base de la feuille 5 (figure supplémentaire 4b), ce qui s’est traduit par une diminution de la porosité dans cette région, comme l’a révélé l’analyse CT (figure supplémentaire 4c). Pour mieux identifier les régions à la base des feuilles de blé dans lesquelles la différenciation stomatique venait de commencer, nous avons utilisé la microscopie confocale pour analyser la feuille 3 des plantules de blé à un stade de développement relativement précoce. Cette analyse a révélé que les régions les plus distales de l’extrémité de ces feuilles se distinguaient par la présence de complexes stomatiques matures (Fig. 4a) sous-tendus par des espaces d’air relativement grands (Fig. 4b, c). En revanche, dans les régions de la base plus proximale où les cellules épidermiques subissant des divisions caractéristiques de la différenciation stomatique étaient clairement visibles (Fig. 4d), bien que des espaces d’air occasionnels étaient visibles aux interstices de certaines cellules sous-épidermiques adjacentes (Fig. 4e), ils étaient tous deux beaucoup plus petits que ceux observés dans le tissu plus proximal (Fig. 4b) et ne présentaient aucun motif manifeste lié aux stomates différenciés sus-jacents (Fig. 4f).
Progression développementale de la différenciation stomatique et de la formation de l’espace aérien du mésophylle. a-f Images confocales de la feuille 3 de plantules de blé (6n) prises soit au niveau de la région de l’extrémité distale (a-c), soit au niveau de la base proximale (d-f). Les images proviennent de l’épiderme (a, d) ou du mésophylle sous-jacent (b, e), les parois cellulaires étant faussement colorées et superposées en (c, f). Un stomate mature est visible en a, avec deux stomates immatures en d. Un grand espace aérien sous-tend le stomate en a (indiqué par des astérisques en b, c). De petits espaces aériens (astérisques) sont visibles en e, f aux jonctions cellulaires. g-l Images confocales de feuilles d’Arabidopsis à maturité (g-i) ou en début de développement (j-l). Les images proviennent de l’épiderme (g, j) ou du mésophylle sous-jacent (h, k), la paroi cellulaire étant faussement colorée et superposée en i, l. Un stomate mature est visible au centre (g), avec de nombreux stomates à différents stades de développement en j. Un espace aérien relativement grand (astérisques) est visible sous le stomate central (h), tandis que de très petits espaces aériens (astérisques) sont distribués dans le mésophylle immature (k, l) aux jonctions cellulaires. Barre d’échelle c, f = 20 µm ; i, l = 25 µm
Ces résultats soutiennent les hypothèses selon lesquelles la séparation cellulaire se produit dans le mésophylle sous-épidermique dans le cadre d’un programme endogène de développement, mais que la taille et la distribution des espaces aériens finalement formés sont favorisées par la présence de stomates différenciés adjacents. Ces données suggèrent qu’il existe un lien de causalité entre la densité stomatique et la porosité globale du mésophylle, et que les échanges gazeux et la porosité du mésophylle sont fonctionnellement liés.
Pour étudier les moteurs physiologiques potentiels de ces changements, nous avons comparé le taux d’assimilation photosynthétique, la conductance du mésophylle au CO2 (gm) et l’efficacité instantanée de l’utilisation de l’eau (iWUE) des lignées de blé avec différents niveaux de ploïdie. Cela n’a révélé aucune tendance manifeste reliant le taux d’assimilation (Fig. 5a supplémentaire) ou la gm (Fig. 5c supplémentaire) au niveau de ploïdie, et aucune corrélation évidente du taux d’assimilation avec la porosité du mésophylle (Fig. 5e supplémentaire). En revanche, les lignées de blé 6n présentaient une iWUE significativement plus élevée que les lignées 2n et 4n (Fig. 5b supplémentaire ; ANOVA avec Tukey posthoc, P = 0,0005 et P = 0,013, respectivement). Ceci a été reflété par une diminution de la surface de mésophylle exposée par volume calculée à partir de nos analyses CT (Supplementary Fig. 5d), les lignées 6n ayant des valeurs significativement plus basses par rapport aux lignées 2n (ANOVA avec Tukey posthoc, P = 0,0001). Il est intéressant de noter que les mesures du volume des cellules mésophiles par microscopie confocale ont révélé une nette augmentation avec le niveau de ploïdie (figure supplémentaire 5f). En gardant à l’esprit la relation fixe entre la surface et le volume pour des formes similaires, ces données correspondent à une hypothèse selon laquelle, au cours de la sélection du blé moderne, il y a eu une augmentation de la taille des cellules du mésophylle, avec une diminution concomitante de la surface exposée et une diminution de la porosité du mésophylle, ainsi qu’une modification des paramètres stomatiques (augmentation de la taille et diminution de la densité). La façon dont ceux-ci sont mécaniquement liés et intégrés au niveau de la feuille entière pour améliorer l’efficacité de l’utilisation de l’eau attend des recherches supplémentaires.
Pour étudier le lien de causalité potentiel entre la différenciation stomatique et la formation de l’espace aérien mésophile, nous avons tourné nos analyses vers les eudicots, en soumettant une série de lignées transgéniques d’Arabidopsis précédemment montrées comme ayant une densité de stomates altérée27 à une analyse combinée de microCT et d’échange gazeux. Nous nous sommes concentrés sur les lignées dans lesquelles la surexpression de EPF2 conduit à des feuilles avec une densité stomatique significativement plus faible (EPF2OE), et où la perte de EPF2 et de son homologue (EPF1) (mutant epf1epf2) génère des feuilles avec une densité stomatique significativement plus élevée25. Exemplaire images microCT pour chaque ligne sont présentés dans la Fig. 5a, b, d avec des images SEM des stomates présentés dans la Fig. 5e, f, h et la confirmation du phénotype de densité stomatique attendu présenté dans la Fig. 5i.
La porosité de la mésophylle est modulée par les échanges gazeux à travers les pores stomatiques. a-d Rendu microCT 3D de blocs de tissus (résolution = 2.75 μm ; échantillons = 1,1 mm2) et (e-h) images MEB exemplaires de stomates provenant de feuilles des lignées Arabidopsis EPF2-OE, Col-0, focl1-1 et epf1epf2 (barres d’échelle = 10 μm). Les moyennes et l’écart-type sont indiqués pour (i) la densité stomatique (ANOVA, F(3,11) = 19,17, p < 0,0001), (j) la porosité du mésophylle palissadique (ANOVA, F(3,20) = 6,329, p = 0.0034) et (k) conductance stomatique, gs (ANOVA, F(3,20) = 26,22, p < 0,0001) pour les lignées d’Arabidopsis dans a-d, avec n = 6 sauf pour la densité stomatique où n = 4 (focl-1), n = 2 (EPF2-OE) et n = 3 (epf1epf2). Les données de Col-0 sont celles de la réf. 13. Les lignes indiquées par la même lettre ne peuvent pas être distinguées les unes des autres à la limite de confiance p < 0,05 (Tukey posthoc). l La porosité du mésophylle palissadique est tracée en fonction de la conductance stomatique, gs, pour des échantillons individuels de feuilles des quatre lignes d’Arabidopsis, comme indiqué. Les résultats de la régression linéaire sont présentés
Les feuilles d’eudicots (comme on en trouve dans Arabidopsis) se distinguent des feuilles de monocotylédones typiques (exemplifiées par le blé dans cet article) en ce qu’elles présentent de manière caractéristique deux régions mésophylliennes, la palissade adaxiale et les couches spongieuses abaxiales, qui se distinguent par des différences fixées par le développement dans la forme des cellules et l’espace aérien (porosité)13. En sélectionnant les volumes d’intérêt dans les feuilles des lignées d’Arabidopsis, nous avons obtenu des données de porosité distinctes pour les couches palissade et spongieuse respectives. Bien que la comparaison des valeurs moyennes de la porosité globale du mésophylle suggère des différences limitées entre les lignées, cela reflète principalement la similarité des valeurs de la porosité du mésophylle spongieux (figure supplémentaire 6). En revanche, la porosité du mésophylle palissadique (qui est plus fortement associée à l’efficacité photosynthétique que la porosité du mésophylle spongieux13) a montré des différences plus importantes entre les lignées, la palissade epf1epf2 ayant la porosité la plus élevée (Fig. 4j), et la densité stomatique la plus élevée (Fig. 4i). Ces données suggèrent une situation plus compliquée dans la feuille eudicot d’Arabidopsis par rapport à la feuille de blé monocotylédone. Les manipulations qui modifient la densité stomatique chez Arabidopsis peuvent conduire à des altérations manifestes de la porosité du mésophylle, mais le résultat est dicté par l’identité du mésophylle (palissade ou spongieux). Ces observations correspondent à une interprétation selon laquelle un modèle de développement de la différenciation du mésophylle est établi très tôt dans le développement de la feuille (définissant les couches palissadiques et spongieuses chez les eudicots)28,29, l’identité du mésophylle déterminant l’échelle de modulation de la porosité par des facteurs qui se produisent plus tard dans le développement, tels que les signaux associés à la formation des stomates. De plus, comme pour le blé, une analyse des premiers stades de la différenciation stomatique a appuyé l’idée que le degré et l’étendue de la formation de l’espace aérien mésophile étaient modulés par la présence de stomates matures et différenciés. Ainsi, pendant la phase de croissance de la feuille au cours de laquelle les divisions cellulaires épidermiques menant aux stomates se produisaient (Fig. 4j), des espaces aériens étaient visibles aux interstices de certaines cellules sous-épidermiques (Fig. 4k), mais il n’y avait pas de similitude manifeste entre la configuration de ces espaces aériens et les stomates différenciés sus-jacents (Fig. 4l). Au stade de développement où les stomates entièrement différenciés étaient visibles (Fig. 4g), il y avait de nombreux et grands espaces aériens dans tout le mésophylle palissadique sous-épidermique (Fig. 4h), les stomates étant toujours sous-tendus par un espace aérien (Fig. 4i).
Conductance stomatique et modulation de l’espace aérien du mésophylle
Nos données provenant à la fois du blé et d’Arabidopsis soutiennent l’hypothèse que la présence de stomates module le degré de porosité du mésophylle. Cependant, notre observation que la porosité de la palissade dans la lignée EPF2OE d’Arabidopsis n’est pas différente de celle de Col-0 (Fig. 5j), malgré une diminution massive de la densité stomatique (Fig. 5i), suggère qu’il ne s’agit pas simplement d’un processus direct dans lequel la différenciation des cellules de garde entraîne une augmentation/diminution proportionnelle de la séparation des cellules du mésophylle (comme cela a été suggéré7). Une hypothèse alternative (mais non exclusive) est que le fonctionnement réel des stomates pour permettre l’échange de gaz est un facteur majeur reliant la densité stomatique et la porosité du mésophylle. En effet, nos données sur le blé montrent une forte corrélation positive entre la porosité du mésophylle et gs (Figs. 1l, 3i, j). Nous avons testé cette hypothèse chez Arabidopsis en exploitant un mutant stomatique récemment caractérisé, focl1-1, dans lequel les étapes finales de la formation du rebord cuticulaire de garde sont perturbées30. Ceci a pour conséquence que la plupart des stomates forment des pores qui sont initialement complètement recouverts par une couche de lipides/cuticules. Au fur et à mesure qu’ils mûrissent, la cuticule d’environ 10 % des stomates se déchire, ce qui conduit inévitablement à des trous qui doivent permettre un degré limité d’échange gazeux dans et hors de la feuille via les cavités sub-stomatiques visibles qui se forment. Un stomate focl1-1 partiellement couvert est montré dans la Fig. 5g et peut être comparé aux pores stomatiques ouverts observés dans les feuilles Col-0, EPF2OE, et epf1epf2 (Fig. 5e-h). La présence de pores stomatiques partiellement couverts constitue un outil utile pour étudier dans quelle mesure la porosité du mésophylle est liée aux échanges gazeux. Une analyse combinée par paires du microCT et des échanges gazeux des quatre lignées d’Arabidopsis a révélé une corrélation positive hautement significative de gs et de la porosité des palissades (corrélation de Pearson, r2 = 0,471, P = 0,0002 ; Fig. 5l), les données du mutant focl-1 se situant en dessous de celles du témoin Col-0 et au même niveau que les échantillons EPF2OE. Lorsque le taux d’assimilation des feuilles individuelles des plantes mutantes est considéré par rapport à la porosité des palissades, bien qu’il y ait une faible corrélation (Fig. 7a supplémentaire ; corrélation de Pearson, r2 = 0,289, P = 0,007), la relation entre la porosité et l’efficacité d’utilisation de l’eau est beaucoup plus forte (Fig. 7b supplémentaire ; corrélation de Pearson, r2 = 0,526, P = 0.0001), ce qui est cohérent avec l’hypothèse selon laquelle la restriction de la perte d’eau peut être le principal moteur des changements observés dans la structure des feuilles.
Dans l’ensemble, ces observations soutiennent l’idée que, en plus d’un signal direct potentiel provenant des cellules de garde différenciées, le fonctionnement réel des stomates pour permettre l’échange de gaz joue un rôle fonctionnel important dans la promotion des événements de séparation et de croissance des cellules qui contrôlent finalement la porosité du mésophylle.