Les effets des chaînes latérales dans la nucléation de l’hélice diffèrent de la propagation de l’hélice

Résultats et discussion

Notre approche pour évaluer la nucléation de l’hélice utilise des α-hélices substituées par une liaison hydrogène (HBS) dans lesquelles la liaison hydrogène de la chaîne principale N-terminale est remplacée par une liaison covalente (Fig. 1B) (20). Dans des rapports précédents, nous avons décrit des hélices HBS dans lesquelles la liaison hydrogène est remplacée par une liaison carbone-carbone (21). La caractérisation de ces hélices synthétiques par spectroscopie CD et 2D-RMN, ainsi que par analyse de diffraction des rayons X sur monocristal, révèle qu’elles imitent fidèlement la conformation des α-hélices canoniques (21, 22). Fait important, les hélices HBS sont capables d’inhiber les interactions intracellulaires protéine-protéine médiées par les domaines α-hélicoïdaux, soutenant l’hypothèse que ces composés reproduisent la structure et la fonction des α-hélices des protéines (23, 24). Pour analyser l’effet de différents résidus sur la formation des α-hélices, nous avons préparé un analogue de HBS avec une liaison disulfure dont les taux de formation pouvaient être suivis dans des conditions aqueuses (25). Nous avons supposé que les taux de formation de cette liaison fourniraient une sonde unique pour examiner les paramètres biophysiques liés à la formation de l’hélice. Comme la liaison disulfure-HBS (dsHBS) imite la liaison hydrogène intramoléculaire dans les α-hélices, nous avons supposé que l’oxydation du bisthiol (bt) en disulfure (ds) fournirait une mesure directe de la nucléation des hélices (Fig. 1C). Les taux de formation d’hélice pour les peptides modèles ont été mesurés par spectroscopies ultrarapides et se situent dans la gamme des nanosecondes (14, 26⇓⇓-29). Les taux de formation des disulfures sont beaucoup plus lents (de l’ordre de quelques minutes) dans nos conditions de réaction (30). L’échelle de temps dramatiquement plus lente pour la formation de disulfure suggère que les différences dépendantes de la séquence dans le taux de formation de disulfure reflètent des populations de prééquilibre : les résidus avec une propension de nucléation plus élevée favorisent la formation de disulfure.

Les hélices HBS liées à un disulfure peuvent être dérivées de l’oxydation des peptides bisthiol parents permettant une approche facile pour contrôler la conformation du peptide (31⇓⇓-34). Nous avons basé notre conception initiale du peptide sur un court segment du domaine d’activation de p53 : XQEG*FSDLWKLLS (1), où X et G* représentent les résidus contraints par le dsHBS (35). La séquence p53 a été choisie parce qu’elle présente relativement peu de contacts de chaînes latérales tels que les ponts ioniques, qui pourraient biaiser les résultats. Nous avons précédemment caractérisé un certain nombre d’analogues de p53 HBS par spectroscopies CD et RMN nous permettant de prédire les problèmes d’agrégation potentiels qui peuvent affecter les constructions stabilisées (36⇓-38). Le peptide p53 de bisthiol est faiblement hélicoïdal dans les tampons aqueux à 295 K. La spectroscopie CD (Fig. 2A) montre que le dsHBS 1 de p53 est hautement hélicoïdal comparé au peptide bt parent (25). Nous avons sélectionné A, G, D, I, K, L, P, et V comme résidus invités pour cette étude. Cette sélection comprend des résidus aliphatiques représentatifs à chaîne droite et β-branchés ainsi que des chaînes latérales chargées positivement et négativement.

Après des expériences initiales, le peptide 1 a été modifié en remplaçant les résidus natifs d’acide glutamique et de phénylalanine par de la lysine et de l’alanine, respectivement, pour obtenir 2Λ : XΛKG*ASDLWKLLS. La nouvelle séquence a été conçue pour éviter les interactions potentielles des chaînes latérales entre les résidus invités (Λ) et la position i + 3 correspondante ; la lysine a été incorporée pour augmenter la solubilité dans l’eau de l’hôte. La deuxième position a été choisie pour l’introduction des invités car la conformation de ce résidu est impliquée dans l’induction de l’hélice près de l’extrémité N (39, 40). La conformation hélicoïdale de la ds-2A : XAKG*ASDLWKLLS a été évaluée en utilisant une combinaison d’études de RMN 1D, de spectroscopie de corrélation totale et de spectroscopie de corrélation à effet Overhauser nucléaire à cadre tournant (ROESY) dans des solutions aqueuses (texte SI, tableau S1 et figure S1). Les spectres ROESY ont révélé des pics croisés d’effet Overhauser nucléaire (NOE) indiquant une structure hélicoïdale, y compris des NH-NH séquentiels (i et i + 1) et plusieurs NOE de plus longue portée (entre i et i + 3/i + 4) (Texte SI, Tableau S2). Il est important de noter que tous les angles dièdres ϕ du squelette, calculés à partir des constantes de couplage 3JNHCHα, sont dans la plage attendue pour les conformations hélicoïdales (Texte SI, Tableau S1) (41, 42). Les constantes de couplage observées pour les résidus au sein du macrocycle ne diffèrent pas du reste de la chaîne, ce qui indique que la contrainte du disulfure induit fidèlement une conformation α-hélicoïdale. La structure en solution de ds-2A a été déterminée à partir de 48 pics croisés ROESY et 11 angles ϕ calculés en utilisant la recherche conformationnelle de Monte Carlo dans Macromodel 2014. Une superposition des 20 structures de plus basse énergie pour ds-2A est présentée dans la figure 2B. Notamment, le macrocycle contraint par le disulfure ne perturbe pas l’extrémité N de l’hélice α. Dans l’ensemble, avec la spectroscopie CD, les études RMN confirment la stabilisation d’une conformation α-hélicoïdale majeure dans les peptides contraints par le dsHBS.

Les peptides bisthiol et HBS ont été synthétisés comme indiqué dans le texte SI, Fig. S2. Nous avons utilisé des conditions d’oxydation douces consistant en 2% (vol/vol) de DMSO pour oxyder les bisthiols (Fig. 2C) (25, 30). Pour séparer les bisthiols et les peptides dsHBS étroitement liés sur HPLC et pour éteindre les groupes thiol, nous avons traité le mélange réactionnel avec un dérivé de maléimide (43). La séparation adéquate des peptides bisthiol et disulfure sur HPLC nous a permis de quantifier les taux de formation de disulfure pour chaque séquence à partir de l’analyse des surfaces de pic HPLC (Fig. 3A et Fig. S3). Les taux initiaux de formation de disulfure sont tracés dans la Fig. 3B, et les données tabulées sont présentées dans le tableau 1.

Nous constatons que la propension à la nucléation de l’alanine est plus forte que celle de la glycine, alors que la formation de la liaison disulfure avec la proline comme invité est trop lente pour être mesurée avec précision. Ces résultats sont cohérents avec les relations connues : la glycine est un résidu très flexible, tandis que la proline ne contribue à l’hélicité qu’en tant que résidu N-cap et non à d’autres positions dans l’hélice. Ces résultats indiquent également que la conformation du macrocycle influence les taux de formation du disulfure. Si les taux de formation de la liaison étaient indépendants de la conformation du macrocycle, la substitution d’une seule glycine à la place d’une alanine n’aurait pas d’effet significatif. Il est probable que la chaîne peptidique au-delà du macrocycle putatif influence la conformation de prééquilibre, mais comme le peptide bisthiol est largement non-α-hélicoïdal, nous nous attendons à ce que cet effet soit subtil et équivalent pour chaque mutant.

Les séquences de leucine et d’alanine sont similaires dans leurs taux de formation de disulfure, comme on pourrait s’y attendre à partir des valeurs de propension de la littérature (tableau 1) (6). Ces résultats fournissent des mesures utiles pour évaluer le potentiel de notre modèle synthétique en tant que sonde de nucléation des hélices. De manière surprenante, nos investigations révèlent que les résidus β-branchés ne sont pas préjudiciables à la nucléation de l’hélice α. En effet, la vitesse de formation du disulfure avec la valine est presque la même que celle de l’alanine et de la leucine, alors que l’isoleucine entraîne une légère diminution. Les résidus chargés, la lysine et l’aspartate, ralentissent la vitesse de réaction au niveau de la glycine. Comme l’acide aspartique est un briseur d’hélice connu alors que la lysine est considérée comme un résidu stabilisateur d’hélice (44, 45), ces résultats suggèrent que les résidus chargés participent potentiellement aux interactions à longue portée. Bien que les séquences de cette étude aient été conçues pour minimiser la dépendance au contexte, les interactions du squelette ne peuvent être complètement exclues. La spectroscopie CD montre que cinq des huit séquences dsHBS ont un contenu hélicoïdal très similaire ; la substitution de la glycine, de la proline et de l’acide aspartique diminue l’hélicité (Fig. 3C). Nous conjecturons que la stabilité hélicoïdale de la séquence contrainte n’est pas un déterminant majeur de la formation du taux de disulfure. La comparaison des séquences de lysine et d’acide aspartique apporte un soutien à cette hypothèse, car ces séquences présentent des taux de formation de disulfure similaires, alors que les peptides contraints présentent des stabilités hélicoïdales différentes. Les résidus chargés à l’extrémité des hélices peuvent influencer positivement ou négativement la stabilité de l’hélice en fonction de leurs interactions avec le macrodipôle de l’hélice (46). Cependant, ces interactions macrodipolaires ne devraient pas influencer le processus de nucléation de l’hélice car celle-ci n’est pas encore organisée.

Pour obtenir un soutien théorique à nos observations expérimentales, nous avons calculé les barrières d’activation à la formation d’une liaison hydrogène i à i + 4 dans les séquences peptidiques en utilisant des simulations métadynamiques (47, 48). Les transitions hélix-coil ont été précédemment étudiées à l’aide de simulations de dynamique moléculaire afin d’analyser la propension à l’hélice et les échelles de temps de nucléation, mais, à notre connaissance, l’effet des mutations ponctuelles sur la nucléation de l’hélice n’a pas été exploré systématiquement (28, 39, 49). Nous avons déterminé l’impact de différents résidus sur la formation d’un α-turn dans une séquence peptidique modèle acétylée et méthylamidée, Ac-AΛA-NHMe. Nous avons utilisé la distribution Schrodinger 2012 de Desmond 3.1 (50) pour effectuer une simulation métadynamique de 50 ns sur le tripeptide en utilisant le champ de force Amber ff12SB et les paramètres d’ions monovalents associés (51, 52). Des surfaces d’énergie libre bidimensionnelles ont été déterminées et les énergies d’activation ont été identifiées par inspection (Fig. 4). Les énergies d’activation se stabilisent lorsque la durée de la simulation augmente, ce qui suggère que la simulation a convergé à 15 ns (Fig. S4). Nous avons également effectué les simulations en triplicata et mesuré l’écart-type moyen entre les surfaces d’énergie libre résultantes (Fig. S4). L’analyse révèle que tous les résidus invités (Λ), à l’exception de la proline, échantillonnent des angles dièdres correspondant aux régions α-hélice, β-brin et polyproline II (PPII) gauches et droites du tracé de Ramachandran (Fig. 4A). Le tracé du tripeptide contenant de la proline ne présente que les minima α et PPII (Fig. 4B). Les tracés des 18 autres résidus invités dans Ac-AΛA-NHMe sont présentés dans la Fig. S5. La fraction pondérée des populations α, β et PPII pour différents résidus invités est tracée dans la Fig. 4C. Pour calculer la barrière de formation de l’hélice, nous avons comparé la hauteur du pic le plus court entre le bassin d’énergie le plus bas correspondant aux angles dièdres PPII ou β et le dièdre α-hélice pour chaque résidu (Fig. 4D). Les angles dièdres PPII se sont avérés être la conformation de plus basse énergie pour la plupart des résidus invités dans nos calculs.

Les résultats de ces calculs sont en corrélation avec les données expérimentales et suggèrent que la barrière à la préorganisation de la conformation α-hélicoïdale ne suit pas les échelles de propension. Bien que les énergies d’activation reflètent les populations de départ et les profils énergétiques des conformations α et β ou PPII, elles fournissent une jauge pour estimer la difficulté, dépendante des résidus, d’adopter une conformation α-hélicoïdale. Les valeurs de ∆G‡ calculées identifient les résidus invités avec des taux de repliement rapides et lents, mais suggèrent que les taux de plusieurs autres ne sont pas facilement distinguables. Dans l’ensemble, les calculs soutiennent les observations expérimentales selon lesquelles les échelles de propension hélicoïdale ne sont pas applicables à la nucléation de l’hélice.