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Le principe de base pour rendre visibles les changements de phase en microscopie à contraste de phase consiste à séparer la lumière d’éclairage (arrière-plan) de la lumière diffusée par l’échantillon (qui constitue les détails de premier plan) et à les manipuler différemment.
La lumière éclairante en forme d’anneau (verte) qui traverse l’anneau du condenseur est focalisée sur l’échantillon par le condenseur. Une partie de la lumière éclairante est diffusée par le spécimen (jaune). La lumière restante n’est pas affectée par le spécimen et forme le fond lumineux (rouge). Lors de l’observation d’un spécimen biologique non coloré, la lumière diffusée est faible et généralement déphasée de -90° (en raison de l’épaisseur typique des spécimens et de la différence d’indice de réfraction entre le tissu biologique et le milieu environnant) par rapport à la lumière de fond. Cela conduit à ce que le premier plan (vecteur bleu) et l’arrière-plan (vecteur rouge) aient presque la même intensité, ce qui entraîne un faible contraste de l’image.
Dans un microscope à contraste de phase, le contraste de l’image est augmenté de deux façons : en générant une interférence constructive entre les rayons lumineux diffusés et l’arrière-plan dans les régions du champ de vision qui contiennent le spécimen, et en réduisant la quantité de lumière d’arrière-plan qui atteint le plan de l’image. Tout d’abord, la lumière de fond est déphasée de -90° en la faisant passer à travers un anneau de déphasage, ce qui élimine la différence de phase entre le fond et les rayons lumineux diffusés.
Lorsque la lumière est ensuite focalisée sur le plan image (où est placée une caméra ou un oculaire), ce déphasage fait que les rayons lumineux d’arrière-plan et diffus provenant des régions du champ d’observation qui contiennent l’échantillon (c’est-à-dire , l’avant-plan) à interférer de manière constructive, ce qui entraîne une augmentation de la luminosité de ces zones par rapport aux régions qui ne contiennent pas l’échantillon. Enfin, l’arrière-plan est atténué de 70 à 90 % par un filtre gris annulaire ; cette méthode maximise la quantité de lumière diffusée générée par la lumière d’illumination (c’est-à-dire l’arrière-plan), tout en minimisant la quantité de lumière d’illumination qui atteint le plan de l’image. Une partie de la lumière diffusée qui éclaire toute la surface du filtre sera déphasée et atténuée par les anneaux, mais dans une mesure bien moindre que la lumière de fond,qui n’éclaire que les anneaux de déphasage et de filtre gris.
Ce qui précède décrit le contraste de phase négatif. Dans sa forme positive, la lumière de fond est au contraire déphasée de +90°. La lumière de fond sera donc déphasée de 180° par rapport à la lumière diffusée. La lumière diffusée sera alors soustraite de la lumière d’arrière-plan pour former une image avec un premier plan plus sombre et un arrière-plan plus clair, comme le montre la première figure.
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