Comment les protéines Rb contrôlent la prolifération cellulaire n’est pas complètement compris. Il a été établi que la protéine RB s’associe à une grande variété de facteurs de transcription et de complexes associés à la chromatine.
La liaison de la protéine Rb inhibe la capacité d’activation transcriptionnelle des facteurs E2F, masquant le domaine d’activation transcriptionnelle et, dans certains cas, convertissant les facteurs E2F en répresseurs de transcription. L’importance de l’interaction Rb-E2F dans le contrôle de la croissance cellulaire est démontrée par la constatation que tous les mutants naturels de Rb isolés à partir de tumeurs humaines n’ont pas la capacité de se lier et de réguler négativement E2F (Qian et al…, 1992).
Les protéines Rb inhiberaient l’expression des gènes régulés par E2F de deux façons (Dyson et al., 2002) : en se liant directement et en bloquant le domaine d’activation des protéines E2F ou par répression active via le recrutement des HDAC, des facteurs SWI/SNF, des protéines du groupe Polycomb (Dahiya et al, 2001) ou des méthyltransférases (Vandel et al, 2001).
La liaison aux facteurs de transcription E2F
La famille des facteurs de transcription E2F comprend au moins sept membres de la famille E2F, E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, 2A7E et E2F7.
Un facteur de transcription E2F fonctionnel est constitué d’un hétérodimère contenant un polypeptide E2F et un polypeptide DP (Helin et al, 1993). Chacun des polypeptides E2F peut s’hétérodimériser avec le DP1 ou le DP2 (DP3) (Ormondroyd et al., 1995), bien que le facteur de transcription E2F7 se lie à l’ADN de manière indépendante du DP.
Il existe des différences fonctionnelles et structurelles au sein de la famille E2F. E2F1, E2F2 et E2F3 sont des activateurs transcriptionnels, qui interagissent avec pRB. E2F4 et E2F5 sont des répresseurs transcriptionnels et se lient principalement à Rb2/p130 et p107 (Gaubatz et al., 2000). 2A7E ne semble pas avoir de domaine d’interaction protéique de poche ; il interagit avec les protéines Polycomb et réprime la transcription (Morkel et al., 1997). Les E2F7 et E2F8 récemment identifiés sont également supposés réprimer des promoteurs spécifiques (Di Stefano et al., 2003). Le partenaire d’hétérodimérisation DP ne semble pas déterminer la spécificité de liaison des facteurs E2F pour les protéines de poche. Cependant, les facteurs DP ont une fonction de stabilisation de l’interaction entre les facteurs E2F et les protéines Rb (Helin et al., 1993).
Pendant la réponse de prolifération cellulaire, il y a une expression différente des différents E2F, présentant une augmentation de E2F3 en début de G1 à mi-G1 et avec E2F1 et E2F2 augmentant à la limite G1/S (Johnson et al., 1998). E2F4 et E2F5 sont exprimés tout au long du cycle cellulaire, mais en G0 et au début de G1, ils sont liés au noyau par p107 et Rb2/p130, formant des complexes répresseurs de transcription. p107 et Rb2/p130 recrutent E2F4 dans les noyaux de la cellule, induisant la répression de la transcription des gènes de la phase S et la prolifération cellulaire. Pendant ce temps, pRb est censé se lier à E2F1-3 soit au niveau des promoteurs répondant à E2F, soit séquestré à l’écart de ceux-ci (De La Luna et al., 1996).
Après stimulation, les cellules quiescentes entrent dans le cycle cellulaire, et dans la phase G1 précoce, pRb est phosphorylée et par conséquent les facteurs de transcription E2F1-3 sont libérés, alors que seulement dans la phase G1 moyenne à tardive, nous pouvons observer la perte des complexes Rb2/p130. Par conséquent, à la fin de la phase G1, les protéines Rb sont phosphorylées et se dissocient des E2F ; E2F4 et E2F5 se déplacent vers le cytoplasme et E2F1-3 se lient aux promoteurs répondant à l’E2F dans des sites qui sont souvent différents du site de liaison des protéines répresseurs de l’E2F (Cinti et al., 2000). A la transition de phase G1/S, des complexes contenant p107 en association avec E2F4 peuvent encore être détectés (Mudryj, 1991). Ces complexes E2F4-p107 contiennent également la cycline E ou A et cdk2 (Shirodkar, 1992). On a également montré que les complexes E2F-p130 s’accumulent, lorsque certains types de cellules, y compris les myoblastes et les mélanocytes, subissent une différenciation terminale (Shin et al., 1995).
pRb et les protéines apparentées p107 et Rb2/p130 n’ont pas une fonction totalement redondante dans la régulation de la transcription des gènes E2F ; au contraire, ils montrent une grande redondance au niveau du cycle cellulaire. Par exemple, dans les fibroblastes pRb-/-, il y a une augmentation compensatoire des niveaux de protéine p107 pendant l’arrêt en phase G0/G1 (Sage et al., 2003). Le mécanisme de cet effet antiprolifératif de p107 est inconnu – p107 pourrait remplacer pRb dans la régulation de E2F1-3 ou il pourrait réprimer certains gènes sensibles à E2F qui sont contrôlés par pRb (Lee et al., 2002). En outre, pRb peut également se lier à E2F4 in vitro mais ne parvient pas à réguler le promoteur sensible à E2F dans les cellules p107-/- et p130-/-. Il a été montré que le complexe pRb-E2F4, dans les cellules p107-/-, ne parvient pas à lier les mêmes sites promoteurs qui sont habituellement liés par le complexe p107-E2F4 dans les cellules de type sauvage (Rayman et al., 2002).
Cependant, pRb est impliqué dans la répression d’un ensemble limité de gènes E2F dans les cellules G0 et G1, et récemment son rôle dans la répression du gène de la cycline E a été défini. Le promoteur de la cycline E est en effet dérégulé dans les cellules qui ont perdu pRb, même si le complexe p107/p130-E2F4 est toujours disponible (Herrera et al., 1996). pRb médiatise la répression du promoteur de la cycline E par le recrutement d’HDAC et d’histone méthyltransférase sur un site E2F-SP1 particulier qui est exclusivement lié par les complexes pRb-E2F1-3. La cycline E est déréprimée non seulement par la perte de pRb mais aussi par la perte des protéines E2F1-3, il est donc clair que les protéines E2F1-3 agissent dans ce cas comme des répresseurs au lieu d’activateurs (Wu et al., 2001). p107 ou Rb2/p130 peuvent se substituer à pRb uniquement si elles sont présentes en quantité suffisante pour lier les protéines E2F1-3 (Lee et al., 2002).
PRb peut inhiber la prolifération par un mécanisme indépendant d’E2F. Par exemple, pRb peut induire la formation des corps nucléaires de la leucémie promyélocytaire (PML) (Fang et al., 2002), augmenter l’expression de p27 (voir ci-dessus), supprimer la signalisation Ras (Lee et al, 2002) et coopèrent avec hLin-9, une protéine qui est impliquée, comme pRb, dans la suppression de la transformation mais de manière indépendante de E2F (Gagrica et al., 2004).
Les complexes répresseurs RB/E2F peuvent également être régulés de manière indépendante de Cdk. Par exemple, le facteur de croissance transformant-β recrute E2F4/p107 et E2F5/p107 par le promoteur c-myc indépendamment de la phase cellulaire, et cela reste stable en présence d’une forte activité de Cdk (Chen et al., 2004). Dans les cellules humaines, il a été remarqué que p107 et p130 sont retirés des promoteurs de gènes régulés par le cycle cellulaire pendant la phase S, mais sont toujours localisés au niveau des promoteurs de gènes apoptotiques (Young et al., 2004). La régulation du complexe RB/E2F de manière indépendante de Cdk n’est pas encore bien comprise.
La liaison aux protéines qui modifient la structure de la chromatine
La répression par les protéines Rb nécessite les domaines conservés A et B de la protéine de poche et semble impliquer l’association d’autres protéines en plus des facteurs E2F. Les protéines Rb répriment la transcription en remodelant la structure de la chromatine par interaction avec des protéines telles que hBRM, BRG1, HDAC1 et SUV39H1 (Shao et al., 1995), qui sont respectivement impliquées dans le remodelage des nucléosomes, l’acétylation/désacétylation des histones et la méthylation.
hBRM et BRG1 sont des homologues mammifères des composants du complexe de remodelage de la chromatine de la levure SNF2/SWI2 (Strober et al., 1996). Il a été démontré que BRG1 et hBRM s’associent à pRB et qu’ils sont impliqués dans la répression médiée par pRb. Une interaction physique entre pRb et BRG1 n’est pas nécessaire pour l’arrêt de croissance induit par pRB et la répression transcriptionnelle des gènes cibles de E2F (Kang et al., 2004).
La histone désacétylase 1 est une HDAC qui a récemment été montrée comme étant recrutée aux complexes E2F par pRb et comme fonctionnant dans la répression de l’expression du gène de la cycline E (Magnaghi-Jaulin et al., 1998). Les histones sont généralement hyperacétylées au niveau des promoteurs des gènes activement transcrits mais sont hypoacétylées au niveau des gènes silencieux. L’histone désacétylase est généralement recrutée sur les promoteurs des gènes par de nombreux régulateurs de la transcription. pRB s’associe à l’activité HDAC in vivo et se lie aux HDAC de classe I (HDAC1-HDAC3) in vitro. La répression médiée par pRB est renforcée par HDAC1 dans des expériences de transfection transitoire, et pour confirmer cette association entre pRb et HDAC, il a été montré que l’inhibition de l’activité HDAC avec la trichostatine A interfère avec la répression médiée par pRB au niveau d’un sous-ensemble de promoteurs régulés par E2F (Zhang et al, 2000). L’histone désacétylase est donc impliquée dans la modulation de l’activité répressive de pRb sur les promoteurs du gène E2F. Le recrutement d’HDAC peut être indirect et accompagné du recrutement d’autres protéines de liaison telles que RBP1, les corépresseurs et les protéines de remodelage de la chromatine (Lai et al., 1999). Rayman et al. (2002) ont montré que dans les cellules Rb-/-, HDAC se trouve sur les promoteurs du gène E2F ; ceci nous a permis d’émettre l’hypothèse que pRb n’est pas strictement nécessaire dans la répression transcriptionnelle de E2F, mais que d’autres mécanismes pourraient être impliqués. Les protéines histone acétyltransférase (CCBP, p300, Tip6, etc.) participent à l’activation des protéines E2F (Condorelli et Giordano, 1997) ; elles interagissent avec le domaine d’activation des protéines E2F et stimulent leur activation.
SUV39H1 est une méthyltransférase qui méthyle spécifiquement K9 de l’histone H3 et coopère avec pRb dans la répression du promoteur des gènes répondant à E2F. Dans les cellules dépourvues de pRb, il n’y a pas d’association de me-K9-H3 dans ces promoteurs (Rea et al., 2000) ; ces résultats ont notamment été développés en étudiant la cycline E, un des meilleurs gènes cibles de E2F modulé par pRb. Tant pRb que SUV39H1 sont directement impliqués dans la répression de la transcription de la cycline E, puisque dans les cellules doublement knockout pRb-/- et SUV39H1-/-, la cycline E est surexprimée. Les protéines Rb sont également capables d’empêcher l’assemblage des complexes de pré-initiation, inhibant l’activité des facteurs de transcription recrutés sur les promoteurs des gènes E2F (Ross et al., 1999).
Le type de répression que les protéines Rb exercent sur la croissance cellulaire dépend du type de protéines corépressives qui se lient aux gènes cibles d’E2F. Ainsi, différents types de répression transcriptionnelle peuvent opérer au niveau du même promoteur dans un état cellulaire différent ou dans un phénotype cellulaire différent (Dimova et Dyson, 2005).
Le complexe pRb/E2F peut également favoriser une répression stable indépendamment de la position du cycle cellulaire ou en étant résistant à la progression du cycle cellulaire. Malheureusement, les mécanismes par lesquels pRb est impliqué dans les processus de répression permanente de la transcription dépendante de E2F ne sont pas bien connus jusqu’à présent. Par exemple, E2F4 peut être trouvé au niveau des promoteurs régulés par E2F en phase S, mais il n’est pas clair s’il agit comme un activateur. Les cellules sénescentes, par exemple, présentent un niveau plus élevé de méthylation H3K9 dans les promoteurs régulés par E2F par rapport aux cellules quiescentes (Narita et al., 2003). Les protéines Rb interviennent dans les gènes sensibles à l’E2F à la fois dans un état quiescent et dans un état sénescent/différencié, le premier étant caractérisé par de faibles niveaux de méthylation de H3K9, et le second par des niveaux élevés de méthylation de H3K9. L’identité de l’histone méthyltransférase qui est recrutée sur le promoteur peut également moduler la transition entre une cellule quiescente et une cellule sénescente/différenciée.