Matériel végétal, conditions de culture et traitements racinaires
Les plantules de type sauvage Medicago truncatula-R108, utilisées pour cette étude, ont été récoltées en 2008 à l’INRA-Montpellier, France, et conservées à – 20 °C dans un tube dont l’espace vide était rempli de coton hydrophile pour réduire l’humidité. Les graines ont été légèrement scarifiées à l’aide de papier de verre (grain P80) puis stérilisées en surface 30 min sous agitation dans une solution préparée en dissolvant 1/4 d’une pastille commerciale d’eau de javel dans 250 mL d’eau additionnée de 30 µL de détergent. Les semences ont ensuite été soigneusement lavées trois fois dans de l’eau stérile sous un flux laminaire. Si du détergent était encore présent, des étapes de lavage supplémentaires étaient effectuées. Après le dernier lavage, les graines ont été maintenues 1 h dans l’eau à température ambiante pour l’imbibition. L’excès d’eau a été éliminé et les graines ont été étalées au hasard sur un milieu aqueux à 1% d’agar (HP 696-Kalys). Les plaques ont été placées à l’envers à 4 °C dans l’obscurité pendant 3 à 4 jours de stratification. Enfin, la germination a été réalisée à température ambiante dans l’obscurité pendant la nuit, en gardant les plaques à l’envers pour permettre une croissance droite des racines en dehors de la gélose, et pour faciliter le transfert ultérieur sur un nouveau milieu de culture. Les plantules ont ensuite été cultivées sur un milieu Fahraeus modifié solidifié avec 1,3% d’Agar (HP 696-Kalys) (milieu Fahraeus modifié : CaCl2 1 mM, MgSO4 0,5 mM, KH2PO4 0,7 mM, Na2HPO4 0,8 mM, Fe EDTA 50 μM, 0,1 mg/L de chacun des micro-éléments suivants : MnSO4, CuSO4, ZnSO4, H3BO3 et Na2MoO4, pH ajusté à 7.5 avec KOH) . Un maximum de 8 plantules avec des racines d’environ 1 cm ont été transférées par boîte de Pétri carrée (12 cm × 12 cm) contenant le milieu de culture et recouverte d’un papier absorbant inerte (Mega International-USA) pour éviter la pénétration des racines. Pendant le transfert, 125 µL d’eau Milli-Q stérile ont été ajoutés à chaque racine pour éviter la sécheresse avant de fermer les boîtes avec du ruban Millipore. Des pochettes noires ont été utilisées pour couvrir la partie inférieure du plat afin de protéger les racines de la lumière. Enfin, les boîtes ont été positionnées avec un angle d’environ 45° par rapport à la verticale dans des salles de culture maintenant des conditions à 24 °C, 60 % d’humidité et 16 h d’éclairage.
Pour tester l’algorithme RHS, les racines ont été soumises à différents traitements. Un premier ensemble de plantes non traitées a été cultivé pendant 3 jours après le transfert, avant d’imager leurs racines au microscope. Pour les conditions traitées, 2 jours après le transfert, les boîtes ont été ouvertes et placées horizontalement pour ajouter 20 mL de solutions de traitement composées soit de 10 nM de facteur Nod (NF), soit de 10 µM d’acide indole-3-acétique (IAA) dilués dans de l’eau Milli-Q stérile. Comme contrôle, les plantes ont été traitées avec de l’eau Milli-Q stérile. Après 1 h d’immersion des racines, l’excès de liquide a été retiré, et les boîtes ont été fermées et remises dans la salle de culture pendant 18 h.
Les graines d’Arabidopsis thaliana (Col0) ont été stérilisées en surface pendant 3 h avec du chlore gazeux produit en mélangeant 3 mL de HCl 37% avec 50 mL d’hypochlorite de sodium 10%. Les graines ont été étalées dans un plat carré (12 cm × 12 cm) rempli de milieu 1/2MS gélifié à l’aide de 0,8% de Plant agar (Duchefa). Le plat a été conservé pendant 2 jours dans l’obscurité à 4 °C pour la stratification, puis à 21 °C, avec un éclairage de 16 h pour la germination et la culture. Après 9 jours, les plantules ont été utilisées pour l’acquisition d’images.
Les graines de Brachypodium distachyon (Bd21-3) ont été décollées de leur enveloppe à l’aide de pinces, puis stérilisées pendant 15 min sur une bascule dans 1 mL de tampon de stérilisation (eau de javel ménagère à 20%, Tween20 à 0,1%) et rincées 4 fois dans de l’eau bidistillée. Les graines ont été déposées dans un plat carré (12 cm × 12 cm) rempli de 1/2MS complété par 1% d’agar, le pôle embryonnaire du grand axe de la graine étant dirigé vers le bas. Après 2 jours de stratification à 4 °C, les plats ont été transférés et placés verticalement dans une chambre de croissance à 28 °C et 16 h d’illumination pour la germination. Les plantules étaient prêtes pour l’imagerie 3 jours après la germination.
Acquisition d’images
Avant de décrire en détail les différentes étapes de la méthode, l’ensemble du pipeline décrivant le processus complet qui englobe l’imagerie, l’analyse Fiji Script, le tri des données et l’ajustement sigmoïde est résumé dans le fichier supplémentaire 2 : Figure S6.
Trois jours après le transfert dans la chambre de croissance (c’est-à-dire 18 h après les traitements spécifiques le cas échéant), les racines ont été excisées des organes aériens et placées entre une lame et une lamelle couvre-objet dans du milieu Fahareus liquide. Un microscope à champ clair (Leica DMI6000 avec platine motorisée x, y, z. Logiciel LAS, lampe halogène Leica, objectif 5× Dry avec ouverture numérique de 0,15, caméra Hamamatsu Orca ER-1395) a été utilisé pour acquérir des images avec une résolution de 19 703 ppi. La largeur RH est en moyenne couverte par 10 pixels. La platine motorisée du microscope et les possibilités de reconstitution en mosaïque du logiciel LAS ont été utilisées pour acquérir et reconstituer toutes les images analysées (des outils analogues sont disponibles gratuitement dans ImageJ et Fiji). La sélection précise de la fin de la zone racinaire à acquérir n’est pas nécessaire, puisque cette sélection sera normalisée ultérieurement avec le modèle sigmoïdal. Pour obtenir des images nettes des RH le long de la racine, des piles Z de cinq images espacées de 100 µm ont été acquises.
Des images en champ clair des racines d’Arabidopsis ont été obtenues avec une résolution de 15 631 ppi en plaçant la boîte de culture ouverte directement sous un stéréoscope Nikon SMZ18, équipé d’un objectif Nikon SHR Plan Apo WD:71 de 0,5×, d’un zoom 8 et d’une caméra Hamamatsu C11440. Trois positions XY ont été acquises par racine en déplaçant manuellement la boîte sous le champ de vision de sorte que deux images consécutives se chevauchent. Aucune pile Z n’était nécessaire.
Les plantules de Brachypodium ont été imagées entre des lames de microscope et des lamelles couvertes remplies d’eau, en gardant les feuilles non couvertes de la lamelle. Les images ont été acquises avec le même système optique que pour les plantules d’Arabidopsis, avec un grossissement final de 40×. Deux positions XY ont été acquises par racine afin d’avoir 2 images consécutives qui se chevauchent. Aucune pile Z n’était nécessaire.
Les images XY obtenues pour Arabidopsis et Brachypodium ont été assemblées dans Fidji à l’aide du plugin 2D Stitching . Si le chevauchement des images n’était pas suffisant pour que 2D Stitching fonctionne correctement, l’assemblage a été exécuté manuellement à l’aide du plugin MosaicJ .
Root Hair Sizer : traitement des images
Tout le traitement des images a été effectué à l’aide du logiciel libre Fiji, mais peut être réalisé également dans le logiciel libre ImageJ avec les plugins AnalyzeSkeleton et Auto_Threshold installés . Comme point de départ, une seule image est nécessaire où tous les RH sont focalisés. Ici, nous avons généré des projections Z en additionnant cinq tranches acquises, mais toute méthode d’acquisition et de traitement produisant une seule image nette des RH le long de la racine peut être employée.
Le reste du traitement peut être appliqué en exécutant l’algorithme RHS disponible dans le fichier supplémentaire 1 : Script 1. Un résumé de toutes les étapes de l’algorithme est également disponible dans le tableau 1 et illustré dans les figures 2 et le fichier additionnel 2 : Fig. S5. Le fichier additionnel 5 : Movie 1 est également disponible pour clarifier la compréhension de l’interface. La première partie du traitement des ERS consiste en la détection de la zone des ERS. La méthode, inspirée par Inoue et al. consiste à seuiller l’intensité des pixels. Un premier traitement permet de détecter le contour de la racine, tandis qu’un second traite uniquement le contour de la racine. Pour éviter la définition manuelle du seuil d’intensité des pixels, un seuillage automatique a été utilisé. La détection de la racine avec les RHs a été réalisée en utilisant la méthode de Bernsen, tandis que l’axe de la racine seule a été détecté par la méthode de Phansalkar (Fichier additionnel 2 : Fig. S7 et Tableau 1-étapes 3 et 4) . Pour lisser et remplir les trous des deux images binaires générées, plusieurs étapes de dilatation et d’érosion des pixels ont été appliquées (Tableau 1-étapes 3.2 et 4.2). L’image de l’axe de la racine a ensuite été soustraite de l’image de la racine entière (racine avec RHs) (Additional file 2 : Fig. S7 and Table 1-step 5) pour obtenir la surface couverte par les RHs seuls. Le bruit de fond a été effacé à l’étape 5.2 (tableau 1-étape 5.2).
Les étapes suivantes nécessitant que la racine soit droite, la ligne moyenne de la racine (RML) est récupérée comme le plus long chemin du squelette obtenu à partir de l’image de l’axe de la racine après avoir exécuté les commandes » Skeletonize » et » Analyse Skeleton (2D/3D) » (fichier additionnel 2 : Fig. S7 et tableau 1-étapes 8.1 et 8.2). L’image RML est ensuite convertie en une sélection poly-linéaire (étapes 8.3 et 8.4), et redressée avec la commande ‘Straighten’ de Fidji (Fichier additionnel 2 : Fig. S7 et Tableau 1-étape 10). Comme ‘Straighten’ génère une image en niveaux de gris, une binarisation supplémentaire est mise en œuvre (Tableau 1-étapes 11 et 12). Dans l’image finale, les pixels RH ont une valeur de 1, et les pixels de l’arrière-plan une valeur de 0.
Dresseur de cheveux : Mesure de la longueur des RH
La mesure de la longueur des cheveux des racines se fait en deux étapes, comme détaillé dans la section » Résultats » (Fig. 2). Premièrement, une sélection rectangulaire est glissée le long de l’axe de la racine de l’image redressée et binarisée des RH, en mesurant la hauteur « L » de la surface des RH à l’intérieur de la sélection à chaque étape (tableau 1-étapes 14.1 à 14.3) avec la formule (1). Ensuite, un nombre donné (typiquement 10) de valeurs individuelles consécutives de L ont été filtrées par Max pour obtenir une valeur de Lmax comme estimation de la longueur des SR (Tableau 1-étapes 14.4 à 14.5). Chaque valeur Lmax est associée à une distance correspondante de l’extrémité de la racine et écrite dans un tableau.
Root Hair Sizer : réglages ajustables
Selon le type de racine et les propriétés de l’image acquise, il peut être nécessaire d’ajuster certains réglages. Les étapes ajustables sont mises en évidence par plusieurs astérisques dans le script RHS, tandis que les paramètres que nous avons employés dans les exemples Medicago présentés sont énumérés dans le tableau 1. Lors du seuillage de l’image, la valeur du rayon pour les méthodes de seuillage de Bernsen et Phansalkar peut être adaptée, par exemple pour des images de résolution différente, ainsi que le nombre d’érosions et de dilatations appliquées directement après. Si le profil du chevelu racinaire et le type de montage optique utilisé pour l’acquisition sont très différents de l’exemple présenté ici, les utilisateurs sont encouragés à personnaliser la stratégie de seuillage pour l’adapter à leurs propres paramètres. Pour les racines d’Arabidopsis, par exemple, la méthode de seuillage de Phansalkar au lieu de Bernsen a été utilisée à l’étape 3 pour détecter la forme des racines, tandis que la méthode de seuillage de Bernsen au lieu de Phansalkar a été utilisée à l’étape 4 pour détecter la forme des racines. De plus, l’étape 5 n’était plus nécessaire (Fichier additionnel 4 : Script 4). Le processus de squelettisation des racines pourrait également nécessiter quelques ajustements. Le degré de simplification de la poly-ligne mettant en évidence la ligne moyenne de la racine obtenue après les commandes ‘Skeletonize’ et ‘Analyse Skeleton (2D/3D)’ peut être ajusté pour des images beaucoup plus grandes ou plus petites. Enfin, lors du processus de redressement, il est important d’ajuster la largeur de la poly-ligne afin qu’elle couvre tous les RH.
Lors de l’exécution de l’ERS, une boîte de dialogue permet à l’utilisateur de sélectionner le segment racinaire à analyser. La largeur w de la sélection d’analyse peut être ajustée de sorte qu’elle soit légèrement plus fine qu’un RH (de 1/2 à 2/3). Enfin, la taille de l’intervalle dans lequel Lmax doit être choisi peut également être adaptée. Un intervalle de 10 sélections pour recueillir Lmax a semblé correct dans les exemples présentés ici. L’effet de la variation de ce paramètre, qui régule la quantité de points de données conservés par rapport à la variabilité des données due, par exemple, à des » trous » dans le profil RH, est illustré dans le fichier supplémentaire 2 : Fig. S8).
Root Hair Sizer propose également d’annoter l’image si certaines parties de la racine doivent être retirées de l’analyse. La position de ces commentaires le long de la racine sont récupérés dans le tableau final par l’annotation de chaque point de données comme 1 et 0 (respectivement la présence et l’absence du commentaire à ce point) sur des colonnes séparées. En outre, à plusieurs étapes, RHS permet à l’utilisateur de vérifier et éventuellement de corriger manuellement le processus automatique réalisé par l’algorithme. Toutes les définitions automatiques et les corrections manuelles sont enregistrées et sauvegardées en tant que région d’intérêt (ROI). Après avoir exécuté l’ERS une première fois, il est possible d’analyser une autre région de la racine en utilisant la région d’intérêt associée à l’image originale en utilisant le script présenté dans le fichier additionnel 6 : Script 2. Pour exécuter ce script, il est important d’utiliser la même largeur RML et de remplir la première boîte de dialogue avec les mêmes noms de commentaires utilisés avec l’algorithme principal de l’ERS.
Traitement des données
Les données collectées avec l’ERS sont triées avec le logiciel de tableur Excel. Pour tous les résultats présentés, les régions présentant un artefact (par exemple, une bulle ou de la poussière) ont été retirées de l’analyse. Pour certaines images, un côté de la racine présentait un RH plus petit sur toute la longueur par rapport à l’autre côté, principalement pour les racines poussant côte à côte. Dans ces cas, seul le côté avec l’humidité relative la plus longue a été conservé pour l’analyse. D’autres tris de données ou paramètres spécifiques sont mentionnés dans les légendes des figures ou dans le texte. Comme décrit ci-dessus dans « Résultats », afin d’ajuster avec précision les points de données, nous procédons à deux ajustements sigmoïdes successifs. Ensuite, comme illustré dans les figures Fig. 3b, Fichier supplémentaire 2 : Figs. S3, S4, nous avons obtenu une bonne estimation de la section de la courbe abritant une forme sigmoïde.
Les données ont été ajustées avec la courbe sigmoïde \(f\left( d \right)\)
Ce premier ajustement fournit le point d’inflexion d50_1 et la longueur d’extension δ_1. Ensuite, nous réglons les limites pour le second ajustement entre d50_1 ± 5δ_1.
L’ajustement sigmoïde a été réalisé à l’aide du logiciel GraphPad Prism. Les données obtenues à partir de chaque image ont été traitées séparément. Un ajustement par les moindres carrés a été appliqué en utilisant les règles suivantes pour définir les valeurs initiales de l’ajustement pour chaque image considérée :
avec Labsolute min et Labsolute max respectivement la longueur RH minimale et maximale mesurée dans toutes les données obtenues le long de toute la racine de l’image considérée.
Mesure de la vitesse de croissance des racines
Cette mesure a été effectuée sur des lots séparés de racines dans les mêmes conditions que pour la mesure de la longueur RH. Après 1 h d’immersion des racines dans la solution de traitement, les boîtes ont été vidées, puis fermées, et la position du RT a été marquée sur le couvercle de la boîte avec un marqueur. Après 18 h d’incubation, la nouvelle position RT a été marquée et la boîte a été scannée. La distance entre deux points consécutifs a ensuite été mesurée à l’aide du logiciel Fiji. Le taux de croissance racinaire peut être mesuré comme le rapport de cette distance par le temps entre les deux mesures. La croissance des racines a été mesurée à partir de deux réplicats biologiques donnant les valeurs suivantes (moyenne ± SE) : non traité : 296 ± 17 µm/h (n = 26) ; H2O : 304 ± 16 µm/h (n = 26) ; NF : 225 ± 15 µm/h (n = 23) ; IAA : 55 ± 3 µm/h (n = 19).
Statistiques
Le logiciel GraphPad Prism a été utilisé pour réaliser l’analyse statistique et l’ajustement sigmoïdal. Tous les détails concernant la taille de l’échantillon, les réplicats biologiques ou les tests plombés sont précisés dans les légendes des figures.
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