La spectroscopie ultraviolet-visible, ou UV-Vis, est l’une des techniques analytiques les plus populaires en laboratoire.
Dans la spectroscopie UV-Vis, on fait passer de la lumière à travers un échantillon à une longueur d’onde spécifique dans le spectre UV ou visible. Si l’échantillon absorbe une partie de la lumière, toute la lumière ne sera pas traversée, ou transmise. La transmission est le rapport entre l’intensité de la lumière transmise et la lumière incidente, et est corrélée à l’absorbance. L’absorbance peut être utilisée de manière quantitative, pour obtenir la concentration d’un échantillon. Elle peut également être utilisée de manière qualitative, pour identifier un composé en faisant correspondre l’absorbance mesurée sur une gamme de longueurs d’onde, appelée spectre d’absorbance, aux données publiées. Cette vidéo présente la spectroscopie UV-Vis et démontre son utilisation en laboratoire pour déterminer la concentration d’un échantillon et la cinétique d’une réaction.
Lorsqu’un photon frappe une molécule et est absorbé, la molécule est promue de son état fondamental à un état d’énergie plus élevé. La différence d’énergie entre les deux est la bande interdite. L’énergie du photon doit correspondre exactement à la bande interdite pour que le photon soit absorbé. La structure chimique détermine la bande interdite ; par conséquent, les molécules ont chacune un spectre d’absorption unique.
L’absorbance suit la loi de Beer, qui stipule que l’absorbance est égale au coefficient d’atténuation molaire multiplié par la longueur du trajet et la concentration. Le coefficient d’atténuation molaire est lié à la capacité du composé individuel à absorber la lumière d’une longueur d’onde spécifique. La longueur du trajet fait référence à la distance parcourue par la lumière à travers l’échantillon, qui est généralement de 1 cm pour les cuvettes standard. La loi de Beer peut être utilisée pour calculer la concentration de l’échantillon, si l’absorptivité est connue, ou une courbe d’étalonnage peut être utilisée.
La technique UV-Vis est souvent appelée technique générale, car la plupart des molécules absorbent la lumière dans la gamme de longueurs d’onde UV-visible. Le domaine UV s’étend de 100 à 400 nm, et le spectre visible de 400 à 700 nm. Cependant, la plupart des spectrophotomètres ne fonctionnent pas dans l’UV profond (100-200 nm), car les sources de lumière dans cette gamme sont coûteuses. La plupart des spectrophotomètres UV-Vis utilisent une lampe au deutérium pour le domaine UV, qui produit de la lumière entre 170 et 375 nm, et une lampe à filament de tungstène pour le domaine visible, qui produit de la lumière entre 350 et 2500 nm.
Puisque la source de lumière est généralement une lampe avec de larges plages de longueurs d’onde, la longueur d’onde d’absorption spécifique est sélectionnée à l’aide de filtres ou d’un monochromateur. Un monochromateur est un dispositif qui sépare les longueurs d’onde de la lumière dans l’espace, puis place une fente de sortie là où se trouve la longueur d’onde de la lumière souhaitée. Le monochromateur peut être balayé sur une gamme de longueurs d’onde pour fournir un spectre d’absorption complet. Cela rend la technique utile pour quantifier et identifier un large éventail de molécules.
Maintenant que les bases de la spectroscopie UV-Vis ont été exposées, jetons un coup d’œil à une expérience UV-Vis simple en laboratoire.
Avant de commencer la mesure, allumez le spectrophotomètre et laissez les lampes se réchauffer pendant une période de temps appropriée pour les stabiliser.
Préparez un blanc en remplissant une cuvette propre avec le solvant de l’échantillon, puis essuyez l’extérieur avec du papier non pelucheux pour éliminer toute empreinte digitale.
Assurez-vous que la cuvette est correctement alignée avec les côtés rainurés hors du trajet du faisceau, et insérez-la dans le spectrophotomètre. Fixez le couvercle pour empêcher la lumière ambiante de pénétrer dans le système.
Mesurez l’absorbance du blanc à une longueur d’onde, ou sur une plage de longueurs d’onde. Enregistrez ou sauvegardez l’absorbance, car elle doit être soustraite de l’absorbance de l’échantillon.
Puis, jetez le blanc et rincez la cuvette deux fois avec l’échantillon. Ensuite, remplissez la cuvette d’environ ¾ de l’échantillon. Essuyez à nouveau l’extérieur de la cuvette, pour vous assurer qu’elle est propre et exempte d’empreintes digitales.
Placez la cuvette dans le spectrophotomètre dans la bonne orientation, et fixez le couvercle.
Collez une mesure ou un spectre d’absorbance à la même longueur d’onde ou à la même plage de longueur d’onde que le blanc. Soustrayez le spectre ou la mesure du blanc, si l’instrument ne le fait pas automatiquement.
À partir du spectre d’absorbance collecté, déterminez le maximum d’absorbance, ou λmax.
Pour quantifier la quantité d’analyte dans l’échantillon, créez une courbe d’étalonnage en utilisant une gamme de concentrations d’analyte connues. Pour plus d’informations sur la façon de construire et d’utiliser une courbe d’étalonnage, veuillez regarder la vidéo de cette collection » Courbes d’étalonnage « .
La mesure de l’absorbance peut également être utilisée pour calculer la cinétique de la réaction en mesurant l’augmentation ou la diminution de la concentration d’un composé tout au long de la réaction. Commencez par prendre une lecture initiale de l’échantillon, le colorant bleu dans ce cas, au maximum de l’absorbance avant la réaction.
Puis, ajoutez rapidement le réactif, l’eau de Javel dans ce cas, pour démarrer la réaction chimique. Remuez-le bien, afin qu’il se mélange à l’échantillon.
Mesurez l’absorbance au maximum de l’absorbance au fil du temps.
Le spectre d’absorbance initial de l’échantillon de colorant bleu est représenté. Les couleurs de fond montrent les couleurs de la lumière dans le spectre visible. Le colorant bleu a un maximum d’absorbance à environ 630 nm.
La cinétique de la réaction entre le colorant bleu et l’eau de Javel a été mesurée au cours du temps. L’absorbance du colorant bleu diminue au fil du temps, car il réagit avec l’eau de Javel. L’absorbance atteint presque zéro après 300 s, ce qui indique que la réaction est presque terminée. Pour plus d’informations sur la cinétique et les réactions, veuillez regarder la vidéo JoVE Science Education « Lois de la vitesse de réaction ».
La spectroscopie UV-Vis est fortement utilisée dans de nombreux domaines de recherche différents pour identifier ou quantifier un échantillon.
Par exemple, la spectroscopie UV-Vis est fortement utilisée dans les domaines biologiques pour quantifier la quantité de protéines dans un échantillon. Un test de Bradford est souvent utilisé pour quantifier les protéines, à l’aide d’un colorant. On prépare d’abord une courbe d’étalonnage de concentrations connues de protéines, en utilisant généralement de l’albumine de sérum bovin, ou BSA. Ensuite, on ajoute du colorant bleu de Coomassie à chacun des étalons et à l’échantillon. L’absorbance du complexe protéine-colorant est ensuite mesurée à 595 nm.
Alternativement, les protéines peuvent être mesurées directement par leur absorbance à 280 nm. Dans cet exemple, la concentration en protéines est quantifiée à l’aide d’un spectrophotomètre à ultra bas volume. Pour de nombreuses protéines, une absorbance de 1 est corrélée à une concentration de 1 mg/mL.
La spectroscopie UV-Vis est également utilisée pour quantifier la quantité de cellules bactériennes dans une culture cellulaire. Pour cette mesure, l’absorbance, ou densité optique, est mesurée à 600 nm. En général, une mesure de l’OD600 de 1 indique la présence de 8 x 108 cellules bactériennes par ml. La mesure de la densité cellulaire tout au long de la croissance de la culture permet de déterminer la courbe de croissance bactérienne, et peut aider à identifier quand une culture est dans sa phase de croissance exponentielle.
L’oxyde d’azote et le dioxyde d’azote, ou NOx, est un sous-produit des gaz d’échappement des automobiles, et peut être nocif pour l’environnement car il forme de l’ozone troposphérique nuisible. On peut mesurer les NOx en les faisant réagir avec une solution d’acide sulfanilique et de napthyl-éthylènediamine. La solution qui en résulte est une molécule de colorant azoïque de couleur rose, dont l’intensité est directement corrélée à la concentration de NOx. Cette concentration peut ensuite être déterminée à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis.
Vous venez de regarder l’introduction de JoVE à la spectroscopie UV-visible. Vous devriez maintenant comprendre les bases du fonctionnement de l’UV-Vis, comment mesurer un échantillon à l’aide d’un UV-Vis et comment corréler l’absorbance à la concentration de l’échantillon.
Merci d’avoir regardé !
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