Abstract
Contexte. Auparavant, nous avons constaté que les femmes ayant un anticorps anticentromère positif présentaient un potentiel altéré de maturation des ovocytes et de clivage des embryons ; le mécanisme possible derrière ce phénomène était encore inconnu. Objectif. Ainsi, la présente étude visait à explorer de manière préliminaire si l’ACA pouvait pénétrer dans les embryons vivants et altérer leur potentiel de développement via une coculture in vitro avec des embryons de souris. Méthodes. Des embryons de souris ont été collectés et utilisés pour une culture in vitro avec un anticorps polyclonal contre la protéine A du centromère (CENP-A) ; ensuite, un test d’immunofluorescence a été réalisé pour déterminer la pénétration de l’anticorps dans les embryons, et le potentiel de développement des embryons a été observé. Résultats. Tous les embryons cultivés avec l’anticorps anti-CENP-A présentaient une immunofluorescence sur le noyau, alors qu’aucun des embryons des groupes témoins ne présentait d’immunofluorescence. En outre, les embryons cultivés avec l’anticorps anti-CENP-A ont connu une baisse de croissance significative par rapport aux témoins. Conclusion. Les embryons de souris peuvent être une cible directe de l’ACA in vitro avant l’implantation. Cependant, le mécanisme précis doit encore être clarifié.
1. Introduction
Une étude récente a révélé des troubles de la maturation ovocytaire et du développement embryonnaire précoce chez les femmes présentant un anticorps anticentromère (ACA) positif dans leur sang périphérique . Plus récemment, nous avons constaté que les femmes positives pour l’ACA avaient un pourcentage significativement plus faible d’ovocytes matures et un taux de clivage embryonnaire par rapport aux femmes négatives pour l’ACA , révélant ainsi l’impact potentiel de l’ACA sur la fertilité féminine. L’ACA est connu pour être l’un des membres des ANA. Il a été découvert pour la première fois en 1980 comme un anticorps spécifique contre le centromère dans le sérum de patients atteints de calcinose, du phénomène de Raynaud, de dysmotilité œsophagienne, de sclérodactylie et du syndrome de télangiectasie (CREST). Aujourd’hui, l’ACA a été reconnue comme un marqueur diagnostique auxiliaire efficace de la sclérose systémique (SSc). Comme cela a été signalé, les femmes atteintes de sclérose systémique sont susceptibles de connaître plusieurs issues défavorables de la grossesse, notamment un taux d’avortement spontané accru, des naissances prématurées, des bébés de petite taille et l’infertilité. En outre, la prévalence de l’infertilité chez les patients atteints de ScS est élevée, et le taux de réussite du traitement de l’infertilité est relativement faible, ce qui nécessite une étude plus approfondie .
Dès les années 1990, des chercheurs ont tenté de micro-injecter de l’ACA dans des œufs de souris, ce qui a entraîné des troubles du mouvement et de la ségrégation chromosomiques . On sait que le kinétochore est le site de fixation des microtubules du fuseau dans la région centromérique d’un chromosome . En outre, il s’agit de la structure dynamique de la mitose, de la méiose et d’autres activités importantes des cellules. Par conséquent, il serait raisonnable de déduire que l’ACA pourrait interférer avec la méiose ou la mitose dans les cellules vivantes.
Le centromère est un complexe ADN-protéine, et son assemblage est corégulé par les chromatines centromériques et leur complexe protéique associé . La protéine de centromère A (CENP-A) est l’une des protéines constitutives du centromère avec des fonctions biologiques relativement claires qui a été principalement étudiée ; son rôle important dans l’assemblage et la mise en œuvre fonctionnelle du centromère a été vérifié à plusieurs reprises . En outre, tout comme la CENP-B, la CENP-A est considérée comme un antigène cible majeur de l’ACA.
On a supposé que l’ACA pourrait être l’un des ANA les plus étroitement associés à une maturation anormale des ovocytes et au clivage des embryons. Par conséquent, l’objectif de la présente étude était d’explorer l’impact potentiel de l’ACA sur les embryons de stade précoce via une coculture in vitro avec des embryons de souris.
2. Matériaux et méthodes
2.1. Embryons de souris
La superovulation a été induite chez des souris ICR consanguines par stimulation avec de la gonadotrophine de sérum de jument gravide (10 UI par voie intrapéritonéale (i.p.)) et de la gonadotrophine chorionique humaine (10 UI i.p. après 48 h) et accouplée avec des mâles ICR. Les souris femelles ont été tuées 24 heures après l’accouplement. Les embryons au stade précoce ont été collectés par dissection des trompes de Fallope et utilisés dans les expériences. Le comité d’éthique du premier hôpital affilié de l’université Sun Yat-Sen a approuvé cette étude.
2.2. Culture in vitro des embryons
Les embryons ont été cultivés dans le milieu sériel de Quinn (Sage, USA). Pour le groupe anticorps, un anticorps polyclonal de lapin dirigé contre le CENP-A de souris (albumine de sérum bovin et sans azide, produits personnalisés d’Abcam, Royaume-Uni) a été ajouté au milieu. La concentration d’anticorps dans le milieu était de 35 μg/mL (modifiée sur la base de la littérature ). Pour le groupe phosphate-buffered saline (PBS) (servant de contrôle), la solution PBS (comprimé PBS, Millipore, Merck, Allemagne) avec le même volume que la solution d’anticorps a été ajoutée au milieu. Le groupe témoin vierge comprenait le milieu sans aucun additif.
2.3. Test d’immunofluorescence
Les deuxième et troisième jours de culture, trois à cinq embryons ont été prélevés dans chaque plat des trois groupes pour le test d’immunofluorescence, afin de détecter si les signaux de l’anticorps anti-CENP-A étaient présents dans les embryons après la coculture. Les procédures pour le test d’immunofluorescence étaient les suivantes : Les embryons ont été fixés dans du polyoxyméthylène à 4 %, puis imprégnés de Triton X-100 à 0,5 % (Sigma, États-Unis), avant d’être scellés dans du sérum d’âne normal à 5 % (Jackson Immunoresearch, États-Unis). Après cela, les embryons ont été incubés pendant 1 h avec des IgG anti-lapin d’âne marquées au 488 (Invitrogen, UK, dilution 1 : 1000), rincés, incubés avec 1 μg /mL de DAPI (4,6-diamidino-2-phénylindole, dihydrochloride, Cell Signaling Technology, USA) pendant 15 min, rincés à nouveau et fixés dans un plat pour une observation microscopique ultérieure. Afin d’exclure les faux positifs du groupe expérimental, les embryons du groupe anticorps ont été incubés avec du PBS au lieu d’IgG anti-lapin d’âne marqué au 488 (groupe anticorps pour le contrôle).
2.4. Développement des embryons coculturés (test d’embryotoxicité)
La collecte et la culture des embryons pour ce test d’embryotoxicité étaient les mêmes que celles décrites précédemment, sauf que les embryons sont restés dans les plats pendant toute la période de 3 jours. Les embryons de chaque groupe ont été examinés pour déterminer leur stade de développement aux troisième et cinquième jours (le premier jour correspondait au jour de la collecte des ovocytes). Les stades de développement suivants ont été enregistrés : les stades de 6 à 8 cellules le troisième jour, et les stades de blastocyste, morula, 2 à 8 cellules et atretic le cinquième jour.
2.5. Analyse statistique
L’analyse statistique a été réalisée à l’aide de SPSS 13 (SPSS, IL, USA). Un test de chi-deux et des tests de partition du chi-deux ont été utilisés pour comparer les données qualitatives. Une valeur inférieure à 0,05 a été considérée comme statistiquement significative par le test du chi-deux entre les trois groupes, et une valeur inférieure à 0,0167 a été utilisée pour indiquer la signification statistique dans la partition des tests du chi-deux entre les groupes.
3. Résultats
3.1. Immunofluorescence
Tous les embryons cultivés avec l’anticorps anti-CENP-A ont présenté une forte immunofluorescence dans leurs noyaux, alors qu’aucun des embryons des groupes PBS et témoin vierge, ainsi que du groupe anticorps pour le contrôle, n’a présenté d’immunofluorescence (Figure 1).
3.2. Essai d’embryotoxicité
Par rapport aux groupes PBS et contrôle à blanc, les pourcentages d’embryons de stade 6 à 8 cellules au troisième jour, ainsi que les embryons de stade blastula et morula au cinquième jour, étaient significativement plus faibles dans le groupe anticorps. Les potentiels de développement des embryons étaient comparables entre le groupe PBS et le groupe témoin vierge (tableau 1).
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Le premier jour faisait référence au jour de la collecte des embryons. a été considéré comme statistiquement significatif entre les trois groupes. a versus les groupes anticorps et PBS. b versus les groupes anticorps et contrôle à blanc. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. Discussion
En 1999, les chercheurs ont constaté que tous les embryons de souris cultivés avec des IgG antinucléaires purifiées présentaient une forte immunofluorescence sur les cellules embryonnaires et subissaient un trouble de croissance important ou la mort par rapport à ceux cultivés avec des immunoglobulines témoins . Cela indique que les ANA peuvent se lier directement aux embryons in vitro. Cependant, les épitopes précis n’étaient pas connus car aucun antigène nucléaire ou phospholipide n’a été trouvé dans la zona. Dans les embryons de souris au stade 2 cellules, un ensemble de nucléoprotéines est synthétisé de façon transitoire et des changements dans la composition de la chromatine embryonnaire, ce qui suggère que les embryons précoces peuvent posséder des épitopes pour les ANA . En outre, la liaison est relativement spécifique, car les anticorps antithyroïdiens et les anticorps provenant d’individus sains ne présentent aucun signe de liaison aux embryons. La micro-injection de sérum contenant de l’ACA dans des ovocytes de souris pourrait entraver la congression des chromosomes et provoquer un arrêt méiotique en interphase ou un arrêt mitotique en prométaphase .
Dans la présente étude, tous les embryons cultivés avec un anticorps polyclonal anti-CENP-A ont montré une forte immunofluorescence d’anticorps contre les composants nucléaires (dont on a supposé qu’il s’agissait d’anticorps anti-CENP-A) et ont connu un trouble apparent de la croissance embryonnaire, ce qui indique que les embryons de souris peuvent être une cible directe pour certains ACA in vitro avant l’implantation. En outre, pour la majorité des embryons coculturés, toujours un seul ou quelques-uns des blastomères ont montré une fluorescence. Peut-être que la densité des structures dans et autour du centromère empêche l’accessibilité aux anticorps anti-CENP-A, ou que le blastomère présentant une fluorescence détectable était enclin à l’apoptose et présentait des structures relativement lâches qui permettaient l’accessibilité aux anticorps anti-CENP-A. Cependant, le mécanisme précis doit encore être clarifié.
Bien qu’il n’existe pas de concept défini pour l’entrée des anticorps dans les cellules vivantes, et que le mécanisme impliqué soit encore inconnu, ces études ont fourni des preuves de l’entrée des anticorps dans les cellules vivantes. Par exemple, l’IgG anti-ribonucléoprotéine pouvait pénétrer sélectivement dans les lymphocytes T, alors que relativement moins de récepteurs Fc étaient présents à la surface de ces derniers. Cela a suggéré que certains autres mécanismes pertinents pour la régulation non-Fc pourraient être impliqués, qui pourraient être associés à des structures de type antigène sur la surface des lymphocytes, ce qui implique que les anticorps ribonucléoprotéiques interagissent avec les antigènes ribonucléoprotéiques sur la surface cellulaire pour réguler leur accès dans les cellules vivantes .
Cette étude a également révélé que le potentiel de développement embryonnaire était significativement altéré après une culture avec l’anticorps anti-CENP-A, présentant des pourcentages significativement plus faibles d’embryons de stade 6 à 8 cellules au troisième jour et d’embryons de stade blastula au cinquième jour. En fait, une étude précédente a montré que les embryons de souris cultivés avec des IgG purifiées provenant d’un sérum positif à l’ANA présentaient un potentiel de développement embryonnaire considérablement réduit. Les ANA peuvent pénétrer dans les structures subcellulaires contenant les antigènes correspondants, où ils peuvent identifier et se lier aux épitopes dans les régions fonctionnelles importantes. Ces auto-anticorps pourraient inhiber de manière significative la fonction des antigènes à la fois in vivo et in vitro .
En conclusion, les embryons cultivés avec l’anticorps anti-CENP-A ont connu une déficience de croissance significative ou la mort. Ainsi, les embryons pourraient être une cible directe pour l’anticorps anti-CENP-A.
Approbation éthique
Le Comité d’éthique médicale du Premier hôpital affilié de l’Université Sun Yat-sen a approuvé l’étude (n° 75).
Conflits d’intérêts
Ying Ying, Xi Guo, Yiping Zhong et Canquan Zhou déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.
Remerciements
Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (n° 81701518), le Bureau des sciences et technologies et de l’information de Guangzhou (n°. 2014J4100161), le projet de science & technologique de la province du Guangdong (no 2013B021800271), et la Commission de la population et de la planification familiale de la province du Guangdong (no 20132048). Cette étude a été soutenue par le Laboratoire clé pour la médecine de la reproduction de la province du Guangdong du Premier hôpital affilié de l’Université Sun Yat-sen. L’étude a également été soutenue par deux laboratoires clés de The Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University ; il s’agissait du Laboratoire clé des principales maladies obstétricales de la province du Guangdong et du Laboratoire clé de la reproduction et de la génétique des instituts d’enseignement supérieur du Guangdong.
.