Le western blot (WB) est une méthode courante pour détecter et analyser les protéines. Elle est construite sur une technique qui consiste à transférer, également appelé blotting, les protéines séparées par électrophorèse du gel sur une membrane où elles peuvent être visualisées spécifiquement. La procédure a été décrite pour la première fois par H. Towbin et al en 1979 (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) et deux ans plus tard, W. Neal Burnette lui a donné son nom (Burnette, 1981). Towbin et al ont décrit le transfert électrophorétique de protéines de gels de polyacrylamide sur des feuilles de nitrocellulose où le motif original du gel a été obtenu avec précision. La configuration consiste en un ensemble standard de sept étapes, figure 1.
Figure 1. Les étapes standard du Western Blotting.
Les échantillons sont préparés et chargés sur un gel et pendant l’électrophorèse, les protéines chargées négativement se déplacent vers l’anode chargée positivement. Afin d’analyser davantage les protéines, elles sont transférées sur une membrane dans une procédure appelée blotting. Après le transfert, la membrane est bloquée afin d’éviter toute interaction indésirable entre la membrane et la protéine dans les étapes suivantes. Pour visualiser la protéine d’intérêt, la membrane est généralement sondée à l’aide d’un anticorps primaire spécifique de la protéine, suivi d’un anticorps secondaire marqué utilisé pour la détection. Une image est prise de la membrane et le résultat est analysé.
En ajoutant une solution de marqueur séparée dans l’un des puits du gel, il est possible d’estimer la taille de la protéine en plus des interactions entre les anticorps qui sont utilisés pour vérifier la protéine spécifique. La séparation sur le gel n’est pas seulement due à la taille mais aussi, dans une certaine mesure, à la charge moléculaire, aux régions hydrophobes et au degré de dénaturation. La configuration de l’expérience peut être modifiée de nombreuses façons pour répondre au mieux à la demande spécifique. Lors de l’analyse des résultats, il faut tenir compte des variations entre les voies en ce qui concerne les taux de chargement et de transfert entre les blots. En outre, la relation non linéaire du signal généré à travers la gamme de concentration des échantillons est également un aspect à prendre en considération lors de l’interprétation des résultats. Le résultat d’une expérience de BM dépend de trois facteurs importants : la capacité de l’anticorps à se lier à une protéine spécifique, la force de l’interaction et la concentration de la protéine en question. En outre, la spécificité de la liaison à la cible et une faible réactivité croisée sont également des caractéristiques importantes. Le résultat de la BM n’est pas toujours facile à interpréter car la taille de la protéine peut varier par rapport au poids théorique en raison de modifications post-traductionnelles, comme la glycosylation, ou d’interactions avec d’autres protéines. Cependant, la WB est une méthode très courante et presque tous les anticorps commerciaux disponibles ont été validés par cette méthode.
Technologie
Préparation de l’échantillon
La première étape d’une WB consiste à préparer l’échantillon, par exemple un tissu, des cellules ou une autre solution, qui va être analysé. En général, le tissu doit être décomposé par mélange, homogénéisation ou sonication. Des tampons sont ajoutés pour lyser les cellules et solubiliser les protéines et souvent un inhibiteur est ajouté pour empêcher la dénaturation ou la dégradation. Différents types de méthodes de filtration et de centrifugation sont appliqués pour poursuivre la préparation des échantillons. Il est important de déterminer la concentration totale en protéines de l’extrait généré afin de pouvoir charger une quantité spécifique sur le gel pour permettre la comparaison entre les échantillons. Habituellement, un test biochimique est utilisé afin de déterminer la concentration en protéines. L’extrait est ensuite dilué avec un tampon de chargement composé de glycérol et d’un colorant (par exemple, du bleu de bromophénol). Le glycérol est utilisé pour simplifier le chargement en augmentant la densité de l’extrait et le colorant est ajouté pour visualiser l’échantillon. La chaleur est appliquée sur les échantillons afin de casser les structures de la protéine, ce qui aidera à garder la charge négative de la neutralisation (Mahmood & Yang, 2012). De préférence, des contrôles positifs et négatifs sont inclus dans la mise en place pour confirmer l’identité de la protéine ainsi que l’activité de l’anticorps.
Electrophorèse sur gel
Après la préparation de l’échantillon, l’extrait est prêt à être chargé pour séparer les protéines selon leur taille par électrophorèse sur gel. Un champ électrique est appliqué sur le gel qui provoque le déplacement des molécules chargées. Dans la BM, des gels de polyacrylamide sont utilisés pour la séparation des protéines et la méthode est donc appelée électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) lorsqu’elle utilise des conditions natives. Pour les conditions dénaturantes, du dodécylsulfate de sodium (SDS) est ajouté au système et la méthode est donc appelée SDS-PAGE. Le SDS se lie à la protéine et forme une micelle chargée négativement autour de la protéine, quelle que soit sa charge inhérente. Les conditions dénaturantes dissolvent la structure tridimensionnelle des protéines et la charge de la protéine devient relative à sa taille, ce qui entraîne une séparation des protéines uniquement en fonction de leur taille. Lorsque l’on utilise des conditions natives, la mobilité dépend à la fois de la charge et de la taille hydrodynamique permettant la détection des changements de charge dus à la dégradation chimique, aux changements conformationnels dus au repliement ou au dépliage, à l’agrégation ou à d’autres événements de liaison.
Le gel se compose généralement de deux sections de densité différente : (i) un gel d’empilement, et (ii) un gel de séparation, figure 2. Les différences entre ces deux sections résident dans le pH et la concentration du gel. Avec un pH légèrement acide et une concentration plus faible d’acrylamide, le gel d’empilement sépare mal les protéines mais leur permet de former des bandes nettes très définies avant d’entrer dans le gel de séparation. Dans des conditions plus basiques et avec une concentration de gel plus élevée, le gel de séparation permet aux protéines de se différencier par leur taille, car les petites protéines se déplacent plus rapidement dans le gel que les grandes. Les gels préfabriqués sont pratiques, mais il est possible de les couler à la main. Le gel est immergé dans un tampon et les échantillons de protéines et les marqueurs sont chargés dans les puits du gel. Une tension est appliquée sur le gel et les protéines commencent à se déplacer le long du gel en raison de leur charge électrique négative. Il est important de choisir la bonne tension car une tension trop élevée va surchauffer le gel et peut-être déformer les bandes.
Figure 2. Un gel typique immergé dans un tampon.
Transfert sur membrane
Après l’électrophorèse sur gel, les protéines sont transférées sur une membrane de support solide, ce qui constitue la troisième étape du Western Blot. Dans le processus de transfert, une tension est appliquée pour transférer les protéines du gel à la membrane. La configuration comprend des éponges, des papiers filtres, le gel et la membrane, qui est placée entre le gel et l’électrode positive, figure 3. Cela garantit la migration des protéines de charge négative du gel vers la membrane. Il existe trois types de membranes : la nitrocellulose, le difluorure de polyvinylidène (PVDF) et le nylon. Bien que les membranes en nylon soient supérieures à plusieurs égards, la fixation élevée du fond et la coloration irréversible de certains colorants rendent ce type de membrane moins courant que les deux autres. Le principal avantage des membranes en nitrocellulose est leur faible bruit de fond, quelle que soit la méthode de détection. En raison de la taille moyenne relativement importante des pores, les membranes en nitrocellulose ne doivent pas être utilisées pour le transfert de protéines de faible poids moléculaire. De plus, lorsqu’elle est sèche, la membrane devient cassante, ce qui la rend difficile à manipuler. La membrane en PVDF, plus stable, permet le ré-étiquetage et est plus facile à stocker. La nature hydrophobe du PVDF entraîne une grande capacité de liaison des protéines, cependant, en conséquence, le fond est également plus élevé.
Figure 3. Les protéines du gel sont transférées sur une membrane et l’échantillon est visualisé par blocage, ajout d’anticorps et lavage selon un certain calendrier.
Il existe deux méthodes pour le blotting appelées humide et semi-sec. Les conditions humides sont préférées lorsque le transfert doit être efficace et donner une haute qualité concernant des bandes distinctes et nettes. En outre, c’est le meilleur choix pour le transfert de complexes protéiques plus importants. Le gel, la membrane et les papiers filtres sont complètement immergés dans le tampon pendant le transfert et il n’y a aucun risque de dessèchement du gel. Le transfert semi-sèche est plus rapide et nécessite moins de volume de tampon. Cependant, cette méthode de transfert est généralement moins efficace, en particulier pour les protéines plus grandes, et il existe un risque de surchauffe et de séchage du gel lors de l’utilisation de temps de transfert prolongés.
Sondage d’anticorps
La quatrième étape du WB est le sondage d’anticorps. Afin d’empêcher la liaison non spécifique des anticorps à la membrane, plutôt que la liaison spécifique à la protéine d’intérêt, une substance est utilisée pour bloquer les sites résiduels sur la membrane. Les substances couramment utilisées sont le lait sec non gras, l’albumine de sérum bovin (BSA) à 5 % diluée dans du Tris Buffered Saline Tween (TBST), le sérum de chèvre normal, la caséine ou la gélatine de poisson (Mahmood & Yang, 2012). Le lait est facile à se procurer et peu coûteux, cependant il ne convient pas à toutes les étiquettes de détection. La gélatine de poisson donne un fond plus faible mais peut masquer certaines protéines, tout en étant un tampon de blocage relativement coûteux. La BSA est peu coûteuse, tandis que le sérum peut contenir des immunoglobulines et donner lieu à une réactivité croisée. Il est essentiel de choisir soigneusement l’agent de blocage, car aucun des tampons de blocage n’est idéal pour toutes les différentes interactions antigène-anticorps. La procédure de blocage consiste à incuber la membrane dans le tampon de blocage approprié pendant une heure ou plus. En cas d’incubation prolongée, le blocage doit être effectué à +4°C pour exclure le risque d’artefacts de coloration ou d’arrière-plan. Le blocage est un équilibre délicat entre la réduction du fond sans diminuer le signal de la protéine d’intérêt.
La membrane bloquée est ensuite incubée avec l’anticorps primaire. L’anticorps est dilué à une concentration appropriée dans un TBST, une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou un tampon de lavage. Il est préférable d’incuber l’anticorps avec de la BSA si l’anticorps doit être réutilisé. Après le lavage de la membrane, celle-ci est incubée avec l’anticorps secondaire qui se lie à l’anticorps primaire. L’anticorps secondaire est marqué avec un rapporteur. L’utilisation d’un anticorps polyclonal comme anticorps secondaire peut donner lieu à un certain bruit de fond. Dans le cas d’une coloration de fond, l’anticorps secondaire peut être pré-bloqué avec du sérum non immunisé de l’hôte dans lequel il a été généré. L’optimisation de la concentration de l’anticorps secondaire est recommandée en raison des variations assez étendues entre les anticorps ainsi que le système de détection utilisé.
Détection
Dans la cinquième étape d’une BM, le complexe protéine-anticorps-anticorps est détecté sur la membrane. Il existe plusieurs types de marquage de l’anticorps secondaire, par exemple les enzymes, les fluorophores, la biotinylation, la conjugaison à l’or et les radio-isotopes, comme illustré à la figure 4. Parmi les enzymes, la plus courante est la HRP utilisée avec des substances chimioluminescentes, chimifluorescentes ou chromogènes. La HRP a une grande spécificité de substrat qui donne un faible bruit de fond, elle est stable et peu coûteuse. Dans la chimiluminescence, l’enzyme HRP catalyse l’oxydation du luminol à partir du réactif de détection du peroxyde de luminol. La réaction en plusieurs étapes génère une émission de lumière. Certains produits chimiques comme les phénols peuvent renforcer la lumière émise. Une méthode directe est l’utilisation de la fluorescence ; les fluorophores émettent de la lumière après avoir été excités et aucun agent de détection n’est nécessaire. Cette méthode convient bien à l’analyse quantitative Western et, puisque différents fluorophores émettent de la lumière à des longueurs d’onde différentes, il est possible d’effectuer un multiplexage et une détection spécifique de plusieurs protéines à la fois. L’utilisation d’un produit chimique et/ou d’une enzyme pour induire la génération d’un fluorophore actif à partir d’un substrat fluorogène est appelée chimifluorescence. Pour améliorer encore l’intensité du signal, on peut utiliser un système à base de biotine streptavidine en deux étapes. La conjugaison à l’or est également une méthode par laquelle les protéines se colorent en rouge foncé en raison de l’accumulation d’or. Il est également possible d’utiliser des radioisotopes mais ils nécessitent une manipulation spéciale et sont assez coûteux.
Figure 4. Différents systèmes rapporteurs.
Imagerie
L’imagerie est la sixième étape de la BM et la capture peut être analogique en utilisant un film, ou numériquement préformée avec une caméra CCD ou un scanner capturant les différents types de signaux émis. Le dispositif d’imagerie CCD permet une quantification avec une sensibilité de détection élevée et une large gamme linéaire, sans déchets chimiques ni nécessité d’une chambre noire. Il peut être utilisé pour détecter des membranes, des gels colorés ou pour des applications en lumière ultraviolette.
Analyse
La dernière étape d’une BM consiste à analyser les résultats. Dans une application qualitative typique, la présence d’une protéine d’intérêt est confirmée, la quantité est approximée par inspection visuelle, et la taille est déterminée par comparaison avec un marqueur. Les améliorations et les développements, notamment vers des réactifs de détection très sensibles et des techniques d’imagerie avancées, font de la BM un outil potentiel pour l’analyse quantitative. Les applications quantitatives impliquent une définition de la quantité de protéines en termes relatifs ou absolus. Certains facteurs sont à prendre en considération comme la sensibilité, la stabilité du signal, la gamme dynamique linéaire, la normalisation et le rapport signal/bruit. Le minimum de protéines qui peut être vu dans un test donné donne les limites de détection (LOD), et la limite de l’intensité du signal qui peut être utilisée de manière fiable pour une quantification précise est la limite de quantification (LOQ). Les facteurs qui influent sur ces termes sont la qualité et la concentration des anticorps ainsi que les temps d’exposition lorsqu’on considère la quantité minimale de protéines détectée. Un système de signal stable élargit la fenêtre de temps pour atteindre une sensibilité élevée, des expositions multiples et la possibilité de détecter des bandes faibles. La plage qui permet une quantification uniforme et précise où l’intensité du signal est toujours proportionnelle à la quantité de protéines est appelée plage dynamique linéaire. Il est important d’éviter la saturation du signal due à des quantités excessives de protéines ou à des concentrations élevées d’anticorps. Un faible LOD et la quantification des signaux faibles et forts donnent une large gamme dynamique linéaire. La protéine d’intérêt doit être normalisée par rapport à une référence interne qui tient compte des fluctuations de la quantité de protéine chargée dans chaque puits ou des différentes concentrations. Ceci peut être réalisé avec des protéines de référence ou des protéines dopées. Le rapport entre le signal et le bruit est important afin de quantifier correctement la protéine. Ceci est de la plus haute importance lors de la détection de bandes faibles où l’on s’attend à un fond plus élevé.
Exemples spécifiques
Bien que le poids théorique de nombreuses protéines diffère du poids réel en raison de modifications post-traductionnelles, presque tous les anticorps commerciaux sont validés à l’aide de la WB.
Dans le cadre du projet Atlas des protéines humaines, la WB est utilisée pour le contrôle de la qualité des anticorps polyclonaux générés dans le projet. Après purification, les anticorps sont utilisés pour détecter des bandes dans une configuration de lysat et de différents tissus. L’utilisation de siRNA WB est actuellement mise en œuvre pour analyser davantage les anticorps.
L’ensemble du protocole de WB, y compris la dilution des anticorps primaires et secondaires et l’étape de détection finale, est réalisé de manière routinière et aucune optimisation expérimentale spécifique n’est faite pour les anticorps individuels. Dans un premier temps, des lysats de protéines totales provenant de lignées cellulaires et de tissus sélectionnés (15?g de RT-4, U-251MG, foie et amygdale ainsi que 25 ?g de plasma dépourvu de HSA et d’IgG) et d’un marqueur (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder ; Thermo Scientific) sont chargés sur des gels préfabriqués à gradient de 4-20% Criterion SDS-PAGE (Bio-Rad Laboratories) et analysés dans des conditions réductrices, puis transférés sur des membranes PVDF (Bio-Rad Laboratories) en utilisant le turbo Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories) conformément aux recommandations du fabricant. Les gels de gradient SDS-PAGE Criterion ainsi que le marqueur permettent d’analyser les protéines dans les tailles allant de 10 à 250 kDa. Les membranes sont ensuite activées dans du méthanol avant d’être bloquées (lait sec à 5%, Tween 20 à 0,5%, TBS 1× ; tris-HCl 1 mM, NaCl 0,15 M) pendant 1 h à température ambiante sous agitation constante. Les membranes sont ensuite incubées avec l’anticorps primaire HPA dilué à ~0,6?g/ml, pendant 1 h, suivi d’un lavage (1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl, 0,05% Tween) et d’une incubation pendant 45 minutes avec l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase (anti-lapin porcin 1:4000, Dako). Pour les anticorps commerciaux, une dilution de 1:500 est utilisée et l’anticorps secondaire est soit un anti-lapin porcin (1:3000, Dako) soit un anti-souris de chèvre (1:3000, Dako). Une caméra CCD (Bio-Rad Laboratories) est utilisée pour la détection du signal provenant du substrat (Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate ; Millipore).
Un Western Blot typique de l’HPA est visible sur la figure 5.
Figure 5. Résultat typique d’un Western Blot à l’aide de HRP et d’une caméra CCD.
Références et liens
L’article nommant la méthode et la décrivant plus en détail :
Burnette WN&period ;, « Western blotting »&colon ; transfert électrophorétique de protéines de gels de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide sur de la nitrocellulose non modifiée et détection radiographique à l’aide d’anticorps et de protéine A radio-iodée&période ; Anal Biochem&période ; (1981)
PubMed : 6266278
L’article décrit la technique du Western Blotting, la théorie et le dépannage :
Mahmood T et al., Western blot&colon ; technique&comma ; théorie&comma ; et dépannage&période ; N Am J Med Sci&période ; (2012)
PubMed : 23050259 DOI : 10.4103/1947-2714.100998
Le premier article décrivant le transfert électrophorétique de protéines sur une membrane:
Towbin H et al, Transfert électrophorétique de protéines de gels de polyacrylamide sur des feuilles de nitrocellulose&colon ; procédure et quelques applications&période ; 1979&période ; Biotechnologie&période ; (1992)
PubMed : 1422008
Principes et méthodes du Western Blotting – un manuel gratuit fourni par GE Healthcare:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooks
Le Western Blotting dans le projet Human Atlas Protein:
Western Blotting
Wikipedia – liens pertinents :
Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
L’encyclopédie du Western blot – Beaucoup d’informations utiles sur le Western blot ainsi que sur le dépannage, les protocoles et les sélections d’anticorps :
http://www.western-blot.us
Antibodypedia – Une base de données en libre accès sur les anticorps disponibles publiquement et leur utilité dans diverses applications :
http://www.antibodypedia.com
VIDEO : Western blotting étape par étape, un tutoriel réalisé par Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu
.