Come funziona la tecnologia del DNA ricombinante? L’organismo in studio, che sarà utilizzato per donare il DNA per l’analisi, è chiamato organismo donatore. La procedura di base consiste nell’estrarre e tagliare il DNA da un genoma donatore in frammenti contenenti da uno a più geni e permettere a questi frammenti di inserirsi individualmente in piccole molecole di DNA a replicazione autonoma aperte, come i plasmidi batterici. Queste piccole molecole circolari agiscono come vettori per i frammenti di DNA. Le molecole vettore con i loro inserti sono chiamate DNA ricombinante perché consistono in nuove combinazioni di DNA dal genoma donatore (che può essere di qualsiasi organismo) con DNA vettore da una fonte completamente diversa (generalmente un plasmide batterico o un virus). La miscela di DNA ricombinante viene poi usata per trasformare le cellule batteriche, ed è comune che singole molecole vettoriali ricombinanti trovino la loro strada in singole cellule batteriche. Le cellule batteriche sono placcate e lasciate crescere in colonie. Una singola cellula trasformata con un singolo vettore ricombinante si dividerà in una colonia con milioni di cellule, tutte portatrici dello stesso vettore ricombinante. Pertanto una colonia individuale contiene una popolazione molto grande di inserti di DNA identici, e questa popolazione è chiamata clone di DNA. Gran parte dell’analisi del frammento di DNA clonato può essere eseguita nella fase in cui si trova nell’ospite batterico. Più tardi, tuttavia, è spesso desiderabile reintrodurre il DNA clonato nelle cellule dell’organismo donatore originale per effettuare manipolazioni specifiche della struttura e della funzione del genoma. Quindi il protocollo è spesso il seguente:
MESSAGGIO
La clonazione permette l’amplificazione e il recupero di un segmento di DNA specifico da un campione di DNA grande e complesso come un genoma.
In quanto il DNA donatore è stato tagliato in molti frammenti diversi, la maggior parte delle colonie porterà un diverso DNA ricombinante (cioè un diverso inserto clonato). Pertanto, il passo successivo è quello di trovare un modo per selezionare il clone con l’inserto contenente il gene specifico a cui siamo interessati. Quando questo clone è stato ottenuto, il DNA viene isolato in blocco e il gene clonato di interesse può essere sottoposto a una varietà di analisi, che considereremo più avanti nel capitolo. Notate che il metodo di clonazione funziona perché le singole molecole di DNA ricombinante entrano in singole cellule batteriche ospiti, e poi queste cellule fanno il lavoro di amplificare le singole molecole in grandi popolazioni di molecole che possono essere trattate come reagenti chimici. La Figura 12-1 fornisce uno schema generale dell’approccio.
Figura 12-1
La tecnologia del DNA ricombinante permette ai singoli frammenti di DNA di qualsiasi genoma di essere inseriti in molecole di DNA vettore, come i plasmidi, e amplificati individualmente nei batteri. Ogni frammento amplificato è chiamato clone di DNA.
Il termine DNA ricombinante deve essere distinto dai ricombinanti naturali di DNA che risultano dal crossing-over tra cromosomi omologhi nei boteucarioti e nei procarioti. Il DNA ricombinante nel senso usato in questo capitolo è un’unione innaturale di DNA da fonti non omologhe, di solito da organismi diversi. Alcuni genetisti preferiscono il nome alternativo di DNA chimerico, dal nome del mostro mitologico greco Chimera. Attraverso i secoli, la Chimera è stata il simbolo di un’unione biologica impossibile, una combinazione di parti di animali diversi. Allo stesso modo, il DNA ricombinante è una chimera di DNA e sarebbe impossibile senza la manipolazione sperimentale che chiamiamo tecnologia del DNA ricombinante.
Isolamento del DNA
Il primo passo per fare il DNA ricombinante è quello di isolare il DNA donatore e vettore.I protocolli generali per l’isolamento del DNA erano disponibili molti decenni prima dell’avvento della tecnologia del DNA ricombinante. Con l’uso di tali metodi, la maggior parte del DNA estratto dal donatore sarà DNA genomico nucleare negli eucarioti o DNA genomico principale nei procarioti; questi tipi sono generalmente quelli richiesti per l’analisi. La procedura utilizzata per ottenere il DNA vettore dipende dalla natura del vettore. I plasmidi batterici sono vettori comunemente usati, e questi plasmidi devono essere purificati dal DNA genomico batterico. Un protocollo per l’estrazione del DNA plasmidico mediante ultracentrifugazione è riassunto nella Figura 12-2. Il DNA plasmidico forma una banda distinta dopo l’ultracentrifugazione in un gradiente di densità di cloruro di cesio contenente etidiumromuro. La banda plasmidica viene raccolta praticando un foro nella provetta da centrifuga in plastica. Un altro protocollo si basa sull’osservazione che, ad un pH specificalkaline, DNA genomico batterico denatura ma plasmidi non lo fanno. La successiva neutralizzazione precipita il DNA genomico, ma i plasmidi rimangono in soluzione.Fagi come il λ possono anche essere utilizzati come vettori per la clonazione del DNA nei sistemi batterici. Il DNA fagico viene isolato da una sospensione pura di fagi recuperati dal lisato di afago.
Taglio del DNA
La svolta che rese possibile la tecnologia del DNA ricombinante fu la scoperta e la caratterizzazione degli enzimi di restrizione. Gli enzimi di restrizione sono prodotti dai batteri come meccanismo di difesa contro i fagi. Gli enzimi agiscono come forbici, tagliando il DNA del fago e quindi inattivandolo.importante, gli enzimi di restrizione non tagliano in modo casuale; piuttosto, tagliano sequenze target di DNA specifico, che è una delle caratteristiche chiave che li rendono adatti per la manipolazione del DNA. Qualsiasi molecola di DNA, da quella virale a quella umana, contiene siti di destinazione degli enzimi di restrizione per puro caso e quindi può essere tagliata in frammenti definiti di dimensioni adatte alla clonazione. I siti di restrizione non sono rilevanti per la funzione dell’organismo, e non sarebbero tagliati in vivo, perché la maggior parte degli organismi non hanno enzimi di restrizione.
Guardiamo un esempio: l’enzima di restrizione EcoRI (da E. coli) riconosce la seguente sequenza di sei nucleotidi nel DNA di qualsiasi organismo:
Questo tipo di segmento è chiamato palindromo del DNA, il che significa che entrambi i filamenti hanno la stessa sequenza nucleotidica ma in orientamento antiparallelo. L’enzima EcoRI taglia all’interno di questa sequenza ma in una coppia di tagli sfalsati tra i nucleotidi G e A.
Questo taglio sfalsato lascia una coppia di “estremità appiccicose” identiche a singolo filamento. Le estremità sono chiamate appiccicose perché possono legarsi a idrogeno (attaccarsi) a una sequenza complementare. La Figura 12-3 mostra EcoRI che effettua un taglio singolo in una molecola di DNA circolare come un plasmide: il taglio apre il cerchio e la molecola lineare formata ha due estremità appiccicose. La produzione di queste estremità appiccicose è un’altra caratteristica degli enzimi di restrizione che li rende adatti alla tecnologia del DNA ricombinante. Il principio è semplicemente che, se due diverse molecole di DNA vengono tagliate con l’enzima di restrizione, entrambe produrranno frammenti con le stesse estremità appiccicose complementari, rendendo possibile la formazione di chimere di DNA. Quindi, se sia il DNA vettore che il DNA donatore sono tagliati con EcoRI, le estremità appiccicose del vettore possono legarsi alle estremità appiccicose di un frammento donatore quando i due sono mescolati.
Figura 12-3
L’enzima di restrizione EcoRI taglia una molecola di DNA circolare con una sequenza bersaglio, ottenendo una molecola lineare con estremità appiccicose a singolo filamento.
MESSAGGIO
Gli enzimi di restrizione hanno due proprietà utili nella tecnologia del DNA ricombinante. In secondo luogo, molti enzimi di restrizione fanno tagli sfalsati che creano estremità appiccicose a singolo filamento favorevoli alla formazione di DNA ricombinante.
Decine di enzimi di restrizione con diverse specificità di sequenza sono stati identificati, alcuni dei quali sono mostrati nella Tabella 12-1. Noterete che tutte le sequenze bersaglio sono palindromi, ma, come EcoRI, alcuni enzimi fanno tagli sfalsati, mentre altri fanno tagli a filo. Anche i tagli a filo, che mancano di estremità appiccicose, possono essere usati per produrre DNA ricombinante.
Tabella 12-1
Riconoscimento, scissione e siti di modifica di vari enzimi di restrizione.
Il DNA può essere tagliato anche tramite taglio meccanico. Per esempio, agitando il DNA in un frullatore, le lunghe molecole delle dimensioni di un cromosoma si romperanno in segmenti che possono essere uniti a filo.
Unendo il DNA
Più comunemente, sia il DNA donatore che il DNA vettore vengono digeriti con l’uso di un enzima di restrizione che produce estremità appiccicose e poi mescolati in una provetta per permettere alle estremità appiccicose del DNA vettore e donatore di legarsi tra loro e formare molecole ricombinanti. La Figura 12-4 mostra un vettore plasmidico che porta un singolo punto di restrizione EcoRI; quindi la digestione con l’enzima di restrizione EcoRI converte il DNA circolare in una molecola lineare con estremità appiccicose. Anche il DNA donatore da qualsiasi altra fonte (ad esempio, Drosophila) viene trattato con l’enzima EcoRI per produrre una popolazione di frammenti con le stesse estremità appiccicose. Quando le due popolazioni sono mescolate, i frammenti di DNA dalle due fonti possono unirsi, perché si formano doppie eliche tra le loro estremità appiccicose. Ci sono molte molecole di vettore aperte nella soluzione, e molti diversi frammenti EcoRI di DNA donatore. Pertanto, sarà prodotta una serie diversificata di vettori che portano diversi inserti di donatori. In questa fase, anche se le estremità appiccicose si sono unite per generare una popolazione di molecole chimeriche, i backbone di zucchero-fosfato non sono ancora completi in due posizioni in ogni giunzione. Tuttavia, i dorsali possono essere sigillati dall’aggiunta dell’enzima ligasi del DNA, che crea legami fosfodiesteri alle giunzioni (Figura 12-4b). Alcune ligasi sono anche in grado di unire frammenti di DNA con estremità smussate.
Figura 12-4
Metodo per generare un plasmide di DNA chimerico contenente geni derivati da DNA straniero. (Da S. N. Cohen, “The Manipulation of Genes. “Copyright © 1975 by Scientific American, Inc. Tutti i diritti riservati).
Amplificare il DNA ricombinante
Il DNA ricombinante legato entra in una cellula batterica per trasformazione. Dopo essere entrato nella cellula ospite, il vettore plasmidico è in grado di replicarsi perché i plasmidi hanno normalmente un’origine di replicazione. Tuttavia, ora che l’inserto del DNA donatore è parte della lunghezza del vettore, il DNA donatore viene automaticamente replicato insieme al vettore. Ogni plasmide ricombinante che entra in una cellula formerà più copie di se stesso in quella cellula. Successivamente, molti cicli di divisione cellulare avranno luogo, e i vettori ricombinanti saranno sottoposti a più cicli di replicazione. La colonia di batteri risultante conterrà miliardi di copie dell’inserto di DNA del singolo donatore. Questo insieme di copie amplificate del singolo frammento di DNA donatore è il clone di DNA (Figura 12-5).
Figura 12-5
Come funziona l’amplificazione. Il trattamento con enzimi di restrizione del DNA donatore e del vettore permette l’inserimento di singoli frammenti nei vettori. Un singolo vettore entra in un ospite batterico, dove la replicazione e la divisione cellulare producono un gran numero di copie del frammento donatore. (più…)