I microscopi confocali hanno una risoluzione superiore – molto più alta dei microscopi ottici convenzionali – e sono usati principalmente in applicazioni di misurazione. I microscopi confocali possono essere categorizzati come tipo a riflessione o a trasmissione in base al tipo di illuminazione usata per l’imaging. La maggior parte dei microscopi confocali usati nelle applicazioni industriali sono di tipo a riflessione. Essi forniscono un’immagine ad alta risoluzione con tutte le aree a fuoco in tutto il campo visivo, anche per un campione con ammaccature e sporgenze sulla superficie. Permettono la misurazione non distruttiva senza contatto di forme tridimensionali.
I microscopi che usano un laser come sorgente di luce sono conosciuti come microscopi laser*1. Sono anche microscopi confocali. Dal momento che catturano un’immagine bidimensionale attraverso la scansione di fasci di luce a forma di spot o di linea nelle direzioni XY, sono anche un tipo di microscopio a scansione come il microscopio elettronico a scansione (SEM) e il microscopio a sonda a scansione (SPM).
In generale, la performance di un microscopio ottico dipende in gran parte dalla lunghezza d’onda della luce che utilizza e dall’apertura numerica (NA) del suo obiettivo. Non importa quanto piccola diventi la lunghezza d’onda, a meno che non si aumenti la NA, non si può ottenere una risoluzione maggiore. Per osservare modelli fini, hai bisogno di un obiettivo ad alto NA e ad alto ingrandimento. Tuttavia, se si usa un obiettivo ad alto NA e alto ingrandimento per osservare una superficie inclinata o ruvida, non è possibile ottenere la messa a fuoco in ogni punto del campo visivo. Questo perché, man mano che l’NA diventa più alto, la profondità di fuoco diventa meno profonda. C’è un compromesso tra risoluzione e profondità di fuoco. Non è possibile ottenere entrambi allo stesso tempo.
Questo dilemma può essere risolto, tuttavia, se si utilizza un microscopio confocale. Come è possibile? La risposta sta nell’ottica confocale usata sul microscopio.
Immagine ad alta risoluzione
L’ottica confocale offre una caratteristica unica non disponibile nei microscopi convenzionali. Su un’immagine catturata con l’ottica confocale, le aree a fuoco sono evidenziate. Questo è chiamato sezionamento ottico. Non c’è interferenza di luce diffusa indesiderata da aree fuori fuoco nelle sezioni evidenziate. È quindi possibile ottenere un’immagine ad alto contrasto e ad alta risoluzione. Se si esegue una scansione Z*2 e si incollano le immagini ad alta risoluzione di tutte le sezioni evidenziate, è possibile creare un’immagine con tutte le aree a fuoco. In altre parole, se si catturano continuamente le immagini delle aree a più alta luminosità mentre si cambia la posizione di messa a fuoco e si integrano in un’unica immagine, si ottiene un’immagine a fuoco in tutte le aree dell’intero campo visivo. Come risultato, sembra che la profondità di fuoco sia stata resa più profonda.
Immagine 3D
Grazie all’effetto del sezionamento ottico, l’ottica confocale ha un potere risolutivo in direzione Z. L’ottica confocale può riprodurre una struttura tridimensionale utilizzando i dati di posizione Z in ogni punto ottenuto dalla scansione Z. Questo significa che i microscopi confocali possono eseguire varie misure non possibili con i microscopi ottici convenzionali, come la misura della forma, la misura del divario di altezza e la misura della rugosità.
- *1Il microscopio laser è anche conosciuto come microscopio a scansione laser (LSM) o microscopio laser a scansione (SLM).
- *2Z scan è una scansione che viene eseguita lungo l’asse ottico mentre la distanza tra il campione e l’obiettivo viene modificata.
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