In questo post discutiamo il fenomeno della diffrazione del secondo ordine attraverso un monocromatore e i problemi che può causare nella spettroscopia di fluorescenza.
Questo è il secondo di una serie di post del blog (leggi il primo post del blog) dove discutiamo gli errori più comuni commessi e gli artefatti sperimentali che appaiono quando si misurano gli spettri di fluorescenza. Questa lista è stata originariamente ispirata dalla “Galleria dei furfanti di artefatti ed errori di fluorescenza” nell’eccellente libro “Introduzione alla fluorescenza” di David M. Jameson.1 Questi post del blog si baseranno su quella lista con l’esperienza dei nostri ingegneri operativi e scienziati applicativi sugli errori comuni che osservano quando rispondono alle domande dei clienti, visitano i laboratori e… occasionalmente fanno noi stessi.
Che cos’è la diffrazione del secondo ordine?
Nella spettroscopia di fluorescenza vengono utilizzati monocromatori per selezionare le lunghezze d’onda di eccitazione e di emissione. Un tipico spettrometro a fluorescenza sarà composto da due monocromatori; un monocromatore di eccitazione per selezionare la lunghezza d’onda di eccitazione desiderata e un monocromatore di emissione per selezionare quale lunghezza d’onda raggiunge il rivelatore. Per maggiori informazioni su come funziona uno spettrometro a fluorescenza leggi il nostro articolo “Introduzione alle misure di fluorescenza & Strumentazione”.
I monocromatori utilizzano reticoli di diffrazione per isolare la lunghezza d’onda desiderata dalla luce a banda larga incidente. La luce a banda larga viene fatta passare sul reticolo di diffrazione e le diverse lunghezze d’onda che compongono la luce vengono diffratte ad angoli diversi per soddisfare l’equazione del reticolo,
dove m è l’ordine della diffrazione, λ è la lunghezza d’onda della luce diffratta, d è la spaziatura delle scanalature del reticolo, è l’angolo tra la luce incidente e la normale del reticolo, θί è l’angolo tra la luce diffratta e la normale del reticolo. Si può vedere che per costante ogni lunghezza d’onda della luce sarà diffratta con un angolo diverso che permette al monocromatore di isolare la lunghezza d’onda desiderata. Si può anche vedere che per λ costante e costante l’equazione è soddisfatta con angoli diversi a seconda dell’ordine di diffrazione m che può assumere valori interi positivi e negativi (…-2, -1, 0, 1, 2…). Un valore di ±1 è chiamato diffrazione di primo ordine e si verifica vicino alla normale del reticolo ed è il più alto in intensità. Allo stesso modo un valore ±2 è noto come diffrazione del secondo ordine e si verifica ad un angolo meno profondo ed è più debole in intensità. La diffrazione agli ordini superiori segue un modello simile di aumento dell’angolo lontano dalla normale e di riduzione dell’intensità.
In un monocromatore è solo la diffrazione del primo ordine (+1 o -1) che viene utilizzata per selezionare la lunghezza d’onda desiderata e gli ordini superiori sono indesiderati. Tuttavia, a causa dell’ampia gamma di lunghezze d’onda diffratte, gli intervalli angolari occupati dalla diffrazione del primo e del secondo ordine non sono unici. Questo è illustrato nella Figura 1 dove il cono blu rappresenta la gamma di angoli in cui la luce è diffratta del primo ordine e il cono rosso è la gamma di angoli in cui la luce è stata diffratta del secondo ordine e c’è una regione di sovrapposizione condivisa tra queste gamme. Questo intervallo condiviso può essere visto anche dall’equazione del reticolo. Consideriamo la luce a 600 nm che è diffratta del primo ordine (m = 1, λ = 600 nm) e la luce a 300 nm che è diffratta del secondo ordine (m = 2, λ = 300); è chiaro che il lato sinistro dell’equazione del reticolo è lo stesso per entrambi i casi e l’angolo della luce diffratta deve quindi essere equivalente. La conseguenza di ciò è che quando il monocromatore è impostato per trasmettere 600 nm, anche una piccola frazione di luce a 300 nm sarà trasmessa, il che può essere problematico per la spettroscopia di fluorescenza.
La comparsa della diffrazione del secondo ordine negli spettri di fluorescenza
La diffrazione di secondo ordine è un problema particolare per i campioni di dispersione come polveri, cristalli e sospensioni colloidali. Per mostrare l’effetto che la diffrazione di secondo ordine ha sugli spettri di fluorescenza, è stato preparato un campione di fluorescenza a dispersione mescolando una soluzione del colorante fluorescente 2-amminopiridina con Ludox, che è una sospensione colloidale di nanoparticelle di silice e serve da diffusore. La soluzione è stata eccitata a 300 nm e lo spettro di emissione misurato su un intervallo di 250 nm a 950 nm come mostrato in Figura 2 utilizzando lo spettrometro a fotoluminescenza FLS1000 con il filtro di ordinamento (vedi sezione seguente) del monocromatore di emissione disabilitato.Il primo picco a 300 nm corrisponde alla diffusione Rayleigh della luce di eccitazione 300 nm che è stato primo ordine diffratto nel monocromatore di emissione. Questo è seguito dalla fluorescenza di primo ordine della 1-amminopiridina che ha un picco a 380 nm. Questi picchi sono poi ripetuti come artefatti del secondo ordine con un picco di diffusione di Rayleigh a 600 nm e un picco di fluorescenza a 760 nm. Un debole picco di dispersione di Rayleigh del terzo ordine può anche essere appena visto a 900 nm. Confondere gli artefatti del secondo ordine come vera emissione di fluorescenza è un errore comune tra gli utenti inesperti di fluorescenza ed è stato anche la causa di rapporti errati in letteratura. Un esempio di ciò è la pubblicazione di un articolo che riportava nuove deboli bande di emissione a lunga lunghezza d’onda di triptofano e tirosina a 675 nm e 600 nm che si aggiungevano alla ben nota emissione UV di questi residui proteici.3 Sei mesi dopo Hutnik et al. pubblicarono una smentita che dimostrava che la presunta fluorescenza a lunga lunghezza d’onda era semplicemente la diffrazione di secondo ordine della vera emissione UV di triptofano e tirosina a 340 nm e 300 nm.4
Eliminazione della diffrazione del secondo ordine mediante filtri di ordinamento
Sbagliare e pubblicare un artefatto del secondo ordine è un esempio estremo ma un problema più comune è che lo scatter del secondo ordine spesso si sovrappone all’emissione di fluorescenza che viene misurata e distorce lo spettro. La Figura 3a mostra lo spettro di emissione dello stesso campione di Ludox / 2-amminopiridide utilizzato nella Figura 2, ma la lunghezza d’onda di eccitazione è stata spostata a 240 nm e la gamma di emissione ristretta. La dispersione di secondo ordine è ora a 480 nm e si sovrappone con la coda della fluorescenza di 2-amminopiridina che impedisce la misurazione accurata dello spettro. La soluzione a questo problema è quello di utilizzare filtri di ordinamento all’interno del monocromatore. I filtri di ordinamento sono filtri a passaggio lungo che trasmettono solo le lunghezze d’onda al di sopra della lunghezza d’onda di cutoff del filtro. Il principio dei filtri di ordinamento all’interno del monocromatore è illustrato nella figura 4, dove i filtri di ordinamento sono montati in una ruota di filtri situata di fronte alla fenditura di uscita. Quando il monocromatore è impostato per trasmettere 300 nm, il reticolo di diffrazione è ruotato in modo che la luce diffratta di 300 nm sia diretta verso la fenditura di uscita del monocromatore e la ruota del filtro è ruotata in modo che non ci sia un filtro passa lungo nel percorso della luce e la luce di 300 nm sia emessa dal monocromatore come desiderato (immagine a sinistra). Quando il monocromatore è impostato per trasmettere la luce a 600 nm, il reticolo di diffrazione è ruotato in modo che la luce di 600 nm diffratta del primo ordine sia diretta alla fenditura di uscita, accompagnata da una piccola quantità di luce di 300 nm del secondo ordine. La ruota del filtro viene ruotata in modo che ci sia un filtro passa lungo da 400 nm davanti alla fenditura d’uscita che trasmette la luce desiderata da 600 nm mentre blocca la luce indesiderata da 300 nm (immagine a destra).
Il beneficio dei filtri di ordinamento è mostrato nella Figura 3b dove lo spettro è stato rimisurato con la ruota automatica del filtro di ordinamento del monocromatore di emissione di FLS1000 ora abilitata. Il filtro di ordinamento rimuove il picco di dispersione del secondo ordine a 480 nm e vero spettro di 2-aminopyridine si ottiene. Gli strumenti Edinburgh FLS1000 e FS5 spettrometri sono dotati di ruote filtro ordinamento su entrambi i monocromatori di eccitazione e di emissione come standard. Queste ruote filtro sono abilitati per impostazione predefinita e sono completamente automatizzati, con il software Fluoracle ® del FLS1000 e FS5 selezionando i filtri appropriati da utilizzare in base alla scelta della lunghezza d’onda di eccitazione e lunghezze d’onda di emissione. Questi filtri automatici permettono all’utente di misurare ampi spettri di fluorescenza senza mai preoccuparsi degli artefatti del secondo ordine che distorcono le misure.
Speriamo che questo post del blog vi abbia aiutato a capire la presenza di artefatti del secondo ordine negli spettri di fluorescenza e come possono essere evitati utilizzando filtri di ordinamento.
- Introduzione alla fluorescenza, D. M. Jameson, CRC Press (2014)
- Principi di spettroscopia di fluorescenza 3rd, J. R. Lakowicz, Springer (2006)
- Macías, M. C. Pinto, C. Gutiérrez-Mérino, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan Solutions, Biochem Int. 15, 961-969 (1987)
- M. Hutnik, A. G. Szabo, Long-Wavelength Fluorescence of Tyrosine and Tryptophan: a Classic Example of Second Order Diffraction, Biochem Int. 16, 587-591 (1988)
Spettrometri per prevenire la diffrazione del secondo ordine
Gli spettrometri FS5 e FLS1000 stabiliscono lo standard nella spettroscopia di fotoluminescenza a stato stazionario e con risoluzione temporale sia per la ricerca fondamentale che per le applicazioni di routine in laboratorio. Per ulteriori informazioni sui nostri FLS1000 e FS5, perché non contattare un membro del nostro team all’indirizzo [email protected].
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