Risultati e discussione
Il nostro approccio per valutare la nucleazione dell’elica utilizza surrogati del legame a idrogeno (HBS) α-eliche in cui il legame a idrogeno della catena principale N-terminale è sostituito da un legame covalente (Fig. 1B) (20). Nei rapporti precedenti, abbiamo descritto HBS eliche in cui il legame a idrogeno viene sostituito con un legame carbonio-carbonio (21). Caratterizzazione di queste eliche sintetiche da CD e 2D-NMR spettroscopia, così come cristallo singolo analisi di diffrazione dei raggi X, rivela che imitano fedelmente la conformazione di canonici α-eliche (21, 22). È importante notare che gli elicotteri HBS sono in grado di inibire le interazioni proteina-proteina intracellulari mediate dai domini α-elici, sostenendo l’ipotesi che questi composti riproducano la struttura e la funzione degli α-elici proteici (23, 24). Per analizzare l’effetto di diversi residui sulla formazione dell’α-elica, abbiamo preparato un analogo dell’HBS con un legame disolfuro i cui tassi di formazione potevano essere monitorati in condizioni acquose (25). Abbiamo ipotizzato che i tassi di formazione di questo legame avrebbero fornito una sonda unica per esaminare i parametri biofisici relativi alla formazione dell’elica. Poiché il disolfuro-HBS (dsHBS) legame imita il legame idrogeno intramolecolare in α-eliche, abbiamo ipotizzato che il bisthiol (bt) al disolfuro (ds) ossidazione fornirebbe una misura diretta di nucleazione elica (Fig. 1C). I tassi di formazione dell’elica per i peptidi modello sono stati misurati da spettroscopie ultrarapide e cadere nell’intervallo di nanosecondi (14, 26⇓⇓-29). I tassi di formazione del disolfuro sono molto più lenti (dell’ordine dei minuti) nelle nostre condizioni di reazione (30). Il tempo drammaticamente più lento per la formazione del disolfuro suggerisce che le differenze sequenza-dipendenti nel tasso di formazione del disolfuro riflettono popolazioni pre-equilibrio: i residui con maggiore propensione nucleating favoriscono la formazione del disolfuro.
Il disolfuro-legato eliche HBS può essere derivato da ossidazione dei peptidi bisthiol genitori permettendo un approccio facile per controllare la conformazione del peptide (31⇓⇓-34). Abbiamo basato il nostro progetto iniziale del peptide su un breve segmento del dominio di attivazione della p53: XQEG*FSDLWKLLS (1), dove X e G* rappresentano i residui vincolati dal dsHBS (35). La sequenza di p53 è stata scelta perché ha relativamente pochi contatti a catena laterale come i ponti ionici, che possono influenzare i risultati. Abbiamo precedentemente caratterizzato un certo numero di analoghi p53 HBS da CD e spettroscopie NMR che ci permette di prevedere potenziali problemi di aggregazione che possono influenzare costrutti stabilizzati (36⇓-38). Il peptide bisthiol p53 è debolmente elicoidale in tamponi acquosi a 295 K. Spettroscopia CD (Fig. 2A) mostra che il p53 dsHBS 1 è altamente elicoidale rispetto al genitore bt-peptide (25). Abbiamo selezionato A, G, D, I, K, L, P e V come residui ospite per questa indagine. Questa selezione include una catena alifatica diritta rappresentativa e residui β ramificati insieme a catene laterali caricate positivamente e negativamente.
Analisi conformazionale e sintesi di peptidi non vincolati. (A) spettroscopia CD suggerisce che il disolfuro-linked (ds) peptide HBS è altamente elicoidale rispetto al bisthiol genitore (bt). Gli studi CD sono stati eseguiti con 50 μM peptidi in 1 mM PBS. (B) NMR-derivato strutture di ds-2A. Viste di 20 strutture più bassa energia sono mostrati con carbonio, azoto, e gli atomi di ossigeno in grigio, blu e rosso, rispettivamente. Il legame disolfuro è mostrato in colore giallo. (C) Schema della reazione di ossidazione. La conversione di bt-2Λ → ds-2Λ è stata influenzata in condizioni ossidative blande; il bisthiolo non reagito è stato estinto con maleimide 3.
Dopo gli esperimenti iniziali, il peptide 1 è stato modificato sostituendo i residui nativi di acido glutammico e fenilalanina con lisina e alanina, rispettivamente, per ottenere 2Λ: XΛKG*ASDLWKLLS. La nuova sequenza è stata progettata per evitare potenziali interazioni a catena laterale tra i residui ospiti (Λ) e la corrispondente posizione i + 3; la lisina è stata incorporata per aumentare la solubilità in acqua dell’ospite. La seconda posizione è stata scelta per l’introduzione degli ospiti perché la conformazione di questo residuo è implicata nell’induzione dell’elica vicino al terminale N (39, 40). La conformazione elicoidale di ds-2A: XAKG * ASDLWKLLS è stato valutato utilizzando una combinazione di 1D NMR, spettroscopia di correlazione totale, e rotante-frame nucleare Overhauser effetto spettroscopia di correlazione (ROESY) studi in soluzioni acquose (SI Text, Tabella S1, e Fig. S1). Gli spettri ROESY rivelato nucleare effetto Overhauser (NOE) cross picchi indicativi di una struttura elicoidale, tra cui sequenziale NH-NH (i e i + 1) e diversi NOE gamma più lunga (tra i e i + 3 / + 4) (SI Text, Tabella S2). È importante notare che tutti gli angoli diedri ϕ della spina dorsale, calcolati dalle costanti di accoppiamento 3JNHCHα, sono nell’intervallo previsto per le conformazioni elicoidali (SI Text, Tabella S1) (41, 42). Le costanti di accoppiamento osservate per i residui all’interno del macrociclo non differiscono dal resto della catena, indicando che il vincolo disolfuro sta inducendo fedelmente una conformazione α-elica. La struttura della soluzione di ds-2A è stata determinata da 48 ROESY cross-peaks e 11 angoli calcolati ϕ utilizzando Monte Carlo ricerca conformazionale in Macromodel 2014. Una sovrapposizione delle 20 strutture più bassa energia per ds-2A è mostrato in Fig. 2B. In particolare, il disolfuro-constrained macrociclo non perturbare il termine N della α-elica. Nel complesso, insieme con la spettroscopia CD, gli studi NMR confermare la stabilizzazione di un importante α-elica conformazione in dsHBS-constrained peptidi.
I peptidi bisthiol e HBS sono stati sintetizzati come mostrato nel testo SI, Fig. S2. Abbiamo usato condizioni di ossidazione mite costituito da 2% (vol / vol) DMSO per ossidare i bisthioli (Fig. 2C) (25, 30). Per separare il bisthiol strettamente correlati e peptidi dsHBS su HPLC e per spegnere i gruppi tiolici, abbiamo trattato la miscela di reazione con un derivato maleimide (43). Adeguata separazione del bisthiol e peptidi disolfuro su HPLC ci ha permesso di quantificare i tassi di formazione del disolfuro per ogni sequenza dall’analisi delle aree di picco HPLC (Fig. 3A e Fig. S3). I tassi iniziali di formazione del disolfuro sono tracciati in Fig. 3B, e i dati tabulati sono presentati nella Tabella 1.
Analisi del bisthiol alla conversione del disolfuro. (A) I tassi di conversione bt-to-ds sono stati analizzati tramite HPLC, con triptofano come controllo interno. Sono mostrati i risultati HPLC rappresentativi per il peptide 2 con alanina (Λ = A) come residuo ospite. (B) I grafici della conversione da bt a ds per diversi residui ospiti. (C) Gli spettri CD delle sequenze con diversi residui ospiti illustrano che il contenuto elicoidale della maggior parte delle sequenze, ad eccezione delle sequenze con Λ = G, P e D, è identico. Gli studi CD sono stati eseguiti con 50 μM di peptidi in 5 mM KF, pH 7.3.
- View inline
- View popup
Confronto della velocità di formazione del dsHBS con i valori di propensione dell’elica della letteratura
Troviamo che la propensione alla nucleazione dell’alanina è più forte di quella della glicina, mentre la formazione del legame disolfuro con la prolina come ospite è troppo lenta da misurare accuratamente. Questi risultati sono coerenti con le relazioni note: la glicina è un residuo altamente flessibile, mentre la prolina aiuta l’elicità solo come residuo N-cap e non in altre posizioni nell’elica. Questi risultati indicano anche che la conformazione del macrociclo influenza i tassi di formazione del disolfuro. Se i tassi di formazione del legame fossero indipendenti dalla conformazione del macrociclo, la sostituzione di una singola glicina al posto di un’alanina non causerebbe un effetto significativo. È probabile che la catena peptidica oltre il macrociclo putativo stia influenzando la conformazione di pre-equilibrio, ma poiché il peptide bisthiol è in gran parte non-α-elico, ci aspettiamo che questo effetto sia sottile ed equivalente per ogni mutante.
Leucina e alanina sono simili nei loro tassi di formazione del disolfuro, come ci si potrebbe aspettare dai valori di propensione della letteratura (Tabella 1) (6). Questi risultati forniscono una metrica utile per valutare il potenziale del nostro modello sintetico come una sonda di nucleazione dell’elica. Sorprendentemente, le nostre indagini rivelano che i residui β ramificati non sono dannosi per la nucleazione dell’α-elica. Infatti, il tasso di formazione del disolfuro con la valina è quasi lo stesso di quello di alanina e leucina, mentre l’isoleucina porta a una leggera diminuzione. I residui carichi, la lisina e l’aspartato, rallentano la velocità di reazione al livello della glicina. Poiché l’acido aspartico è un noto rompi-elica mentre la lisina è considerata un residuo stabilizzatore dell’elica (44, 45), questi risultati suggeriscono che i residui carichi partecipano potenzialmente alle interazioni a lungo raggio. Anche se le sequenze di questo studio sono state progettate per minimizzare la dipendenza dal contesto, le interazioni della spina dorsale non possono essere completamente escluse. La spettroscopia CD mostra che cinque delle otto sequenze dsHBS hanno un contenuto elicoidale molto simile; la sostituzione di glicina, prolina e acido aspartico abbassa l’elicità (Fig. 3C). Congetturiamo che la stabilità elicoidale della sequenza vincolata non è un fattore determinante per la formazione del tasso di disolfuro. Il confronto tra le sequenze di lisina e di acido aspartico fornisce supporto a questa ipotesi, perché queste sequenze mostrano tassi simili di formazione del disolfuro, mentre i peptidi vincolati mostrano diverse stabilità elicoidali. I residui carichi all’estremità delle eliche possono influenzare positivamente o negativamente la stabilità dell’elica in base alle loro interazioni con il macrodipolo dell’elica (46). Tuttavia, tali interazioni macrodipolari non dovrebbero influenzare il processo di nucleazione dell’elica perché l’elica non è ancora organizzata.
Per ottenere supporto teorico per le nostre osservazioni sperimentali, abbiamo calcolato le barriere di attivazione per la formazione di un legame idrogeno da i a i + 4 in sequenze di peptidi utilizzando simulazioni di metadinamica (47, 48). Transizioni elica-coil sono stati precedentemente studiati utilizzando simulazioni di dinamica molecolare per analizzare la propensione elica e tempi di nucleazione, ma, a nostra conoscenza, l’effetto delle mutazioni puntuali sulla nucleazione elica non è stato esplorato sistematicamente (28, 39, 49). Abbiamo determinato l’impatto di diversi residui sulla formazione di un α-turn in una sequenza peptidica modello acetilata e metilamidata, Ac-AΛA-NHMe. Abbiamo usato la distribuzione 2012 di Schrodinger di Desmond 3.1 (50) per condurre una simulazione metadinamica di 50-ns sul tripeptide usando il campo di forza Amber ff12SB e i parametri associati degli ioni monovalenti (51, 52). Le superfici bidimensionali di energia libera sono state determinate e le energie di attivazione sono state identificate per ispezione (Fig. 4). Le energie di attivazione si stabilizzano come lunghezza della simulazione aumenta, suggerendo che la simulazione convergeva a 15 ns (Fig. S4). Abbiamo anche eseguito le simulazioni in triplicato e misurato la media rmsd tra le superfici di energia libera risultanti (Fig. S4). L’analisi rivela che tutti gli ospiti (Λ) residui, tranne prolina, campione angoli diedri corrispondenti a sinistra e destra α-elica, β-strand, e poliprolina II (PPII) regioni della trama Ramachandran (Fig. 4A). La trama del tripeptide contenente prolina presenta solo i minimi α e PPII (Fig. 4B). Le trame per gli altri 18 residui ospiti in Ac-AΛA-NHMe sono mostrate in Fig. S5. La frazione ponderata delle popolazioni α, β e PPII per i diversi residui ospiti è tracciata in Fig. 4C. Per calcolare la barriera per la formazione di elica, abbiamo confrontato l’altezza del picco più breve tra il bacino di energia più bassa corrispondente al PPII o angoli diedri β al α-elica diedro per ogni residuo (Fig. 4D). Gli angoli diedri PPII sono risultati essere la conformazione a più bassa energia per la maggior parte dei residui ospiti nei nostri calcoli.
Risultati della simulazione metadinamica per valutare la barriera alla formazione di un legame idrogeno da i a i + 4 in un peptide modello (AcAΛA-NHMe) in funzione di diversi residui ospiti. (A e B) Le superfici bidimensionali di energia libera per Λ = alanina e prolina sono mostrate con le altre incluse nel testo SI. I diagrammi di Ramachandran di tutti i residui mostrano bacini di bassa energia per lo spazio dei diedri α, β e poliprolina II (PPII) con l’eccezione della prolina, dove dominano gli spazi PPII e α. (C) Popolazioni ponderate di tutti i bacini a bassa energia corrispondenti agli angoli diedri α, β e PPII. (D) La barriera dell’energia di attivazione tra la regione a più bassa energia corrispondente allo spazio PPII e agli angoli diedri α-elici.
I risultati di questi calcoli sono correlati ai dati sperimentali e suggeriscono che la barriera alla preorganizzazione della conformazione α-elica non segue scale di propensione. Anche se le energie di attivazione riflettono le popolazioni di partenza e i profili energetici delle conformazioni α e β o PPII, esse forniscono un indicatore per stimare la difficoltà dipendente dai residui di adottare una conformazione α-elica. I valori calcolati di ∆G‡ identificano i residui ospiti con tassi di ripiegamento veloci e lenti, ma suggeriscono che i tassi di molti altri non sono facilmente distinguibili. Nel complesso, i calcoli supportano le osservazioni sperimentali che le scale di propensione elicoidale non sono applicabili alla nucleazione dell’elica.