Dalla scoperta di Otto Warburg che le cellule tumorali mostrano un tasso estremamente elevato di assorbimento del glucosio e di produzione di lattato1, una moltitudine di studi ha dimostrato che la maggior parte delle cellule tumorali si basa sulla produzione di energia glicolitica2. Questo ha stimolato i laboratori di tutto il mondo a cercare inibitori della glicolisi come potenziali farmaci anticancro.
Tuttavia, il significato biologico dell’espressione molto alta degli enzimi glicolitici nei tumori è enigmatico. Il primo enzima della glicolisi, l’esochinasi, è espresso a un livello inferiore rispetto agli enzimi successivi3, e ha un’attività specifica e un’affinità relativamente basse per i substrati4,5. Così, la sua attività totale limita il flusso attraverso la glicolisi. Quindi, la sovrabbondanza di enzimi glicolitici nelle cellule tumorali non può promuovere un catabolismo del glucosio più veloce ma deve essere associata ad altri processi non catalitici.
Gli enzimi glicolitici appartengono agli enzimi moonlighting6,7 il cui ruolo fisiologico non è limitato alla funzione catalitica e che possono agire come regolatori di una varietà di processi cellulari. Presentiamo la prova che un enzima glicolitico, l’aldolasi, può essere un potente bersaglio nella terapia anticancro e che l’interruzione di una complessa rete di interazioni intracellulari mediate dall’enzima è fondamentale per la sua azione anticancro.
L’aldolasi è posizionata a metà della via glicolitica e catalizza la scissione reversibile del fruttosio-1,6-bisfosfato (FBP) a diidrossiacetone-3-fosfato e gliceraldeide-3-fosfato. La sua isoforma muscolare (ALDOA), che è l’isoforma di aldolasi più abbondante in quasi tutti i tumori8, può organizzare i filamenti di actina9,10, influenzare le attività di AMPK11,12 e FBP213, e regolare la segnalazione Wnt14,15 e p5316. È stato anche dimostrato che ALDOA è coinvolto nella progressione della fase S/G1 del ciclo cellulare17. Poiché ALDOA partecipa a molti eventi cellulari necessari per la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule tumorali, abbiamo ipotizzato che l’interruzione delle funzioni lunari di ALDOA potrebbe fornire un target preferibile per la terapia anticancro.
I nostri risultati rivelano che nelle cellule cancerose, ma non in quelle normali, la perturbazione dell’interazione di ALDOA con il citoscheletro di actina provoca una sequenza di cambiamenti intracellulari, tra cui un aumento significativo della produzione di ROS, la cessazione della sintesi di ATP e l’aumento dei livelli di calcio, che risultano nell’attivazione della caspasi e nel blocco della proliferazione cellulare. Poiché il meccanismo di questi cambiamenti è indipendente dalla funzione catalitica di ALDOA, concludiamo che la sovraespressione di ALDOA nelle cellule cancerose non è legata alle loro elevate esigenze glicolitiche, ma rappresenta un adattamento con cui le cellule tumorali metastatiche garantiscono l’integrità del loro citoscheletro di actina mentre subiscono la transizione epiteliale-mesenchimale. Così, il meccanismo d’azione presentato qui può avere implicazioni significative per lo sviluppo di nuove terapie antitumorali ad ampio spettro.
UM0112176-a novel ALDOA inhibitor-significativamente riduce la crescita delle cellule tumorali
Per perturbare l’interazione ALDOA con i suoi partner di legame, abbiamo usato un inibitore misto lento di legame di ALDOA (UM0112176; Fig. S1a supplementare) che abbiamo trovato da high-throughput screening della grande biblioteca composta all’Università di Montreal. UM0112176 ha inibito l’attività dell’ALDOA umano con IC50 ∼ 2-5 μM in modo lento (Fig. S1b, c), senza inibire altri enzimi glicolitici (Fig. S1d). Abbiamo verificato la capacità di UM0112176 di inibire l’attività di ALDOA in vivo determinando i livelli cellulari di fruttosio-1,6-bisfosfato e triosio fosfati dopo 24 ore di incubazione delle cellule in presenza dell’inibitore (Fig. S1e supplementare). I risultati hanno mostrato un aumento significativo del titolo del substrato ALDOA e una forte diminuzione dei prodotti di reazione ALDOA sia nelle cellule cancerose (KLN205, tumore squamoso del polmone di topo) che in quelle normali (cultura primaria di astrociti di ratto). Questo è supportato dalla tendenza inversa osservata utilizzando mezzi di coltura cellulare di sola glutammina.
In seguito, abbiamo determinato una curva dose-risposta di UM0112176 e abbiamo scoperto che 10 µM di UM0112176 hanno fortemente ridotto la crescita di tutte le linee cellulari cancerose testate: KLN205, hNSCLC (linea cellulare umana di cancro al polmone non a piccole cellule), BxPC3 (adenocarcinoma pancreatico umano) e AsPC1 (metastasi di adenocarcinoma ascite del pancreas umano) (Fig. 1a). Il tasso di crescita delle linee cellulari normali (astrociti di ratto, cardiomiociti di topo-HL-1 e una linea cellulare epiteliale umana-ME16C) non è stato praticamente influenzato da 10 µM UM0112176 (Fig. 1a). Un trattamento prolungato di 7 giorni con 10 µM UM0112176 ha ridotto di quattro volte il numero di cellule tumorali, mentre il numero di cellule normali è diminuito solo del 25-30% (Fig. 1b).
a La quantità di cellule normali e cancerose osservate quando incubate per 48 h in presenza o assenza di 10 μM UM0112176 e normalizzate rispetto a t = 0. I valori sono dati come media e SD, *p < 0,05 per tutte le linee cellulari normali e tumorali. b La quantità di cellule normali e tumorali che sopravvivono dopo 7 giorni di trattamento con 10 μM UM0112176. I valori sono dati come media e SD, *p < 0.05. c L’effetto di 10 μM UM0112176 (24 h di trattamento) sull’espressione Ki67 in KLN205 e negli astrociti. L’espressione di Ki67 nelle cellule che crescono in assenza dell’inibitore è stata normalizzata al 100%. I valori sono dati come media e SD, *p < 0,05. d L’attivazione della caspasi 3 nelle cellule KLN205 dopo il trattamento con UM0112176 (10 μM, 24 h). Barra = 20 µm. Il grafico sottostante mostra il numero di cellule che mostrano la fluorescenza della caspasi 3 attiva. e L’effetto di UM0112176 sulla morfologia del citoscheletro di actina nella linea cellulare del cancro, KLN205 e hNSCLC, e nelle cellule normali, astrociti e fibroblasti. Bar = 10 µm
Per distinguere se l’inibizione del tasso di crescita cellulare era dovuta a un’elevata mortalità o a un blocco della proliferazione, abbiamo valutato l’espressione cellulare di Ki67 (un marcatore di proliferazione cellulare) e della caspasi attiva (caspasi 3, l’effettore finale dell’apoptosi). I risultati hanno rivelato che nelle cellule cancerose, 10 µM di UM0112176 (24 ore di trattamento) hanno fortemente diminuito il segnale fluorescente legato al Ki67 (Fig. 1c) ed elevato la presenza di caspasi attiva (Fig. 1d). Nelle cellule normali, non sono stati osservati cambiamenti (Fig. 1d) anche dopo 48 ore di trattamento (Fig. supplementare S2a).
Il trattamento con UM0112176 interrompe il citoscheletro di actina e modifica i ROS, il potenziale di membrana mitocondriale, il Ca2+, il DSB e i livelli di ATP nelle cellule cancerose ma non in quelle normali
Per chiarire il meccanismo di azione di UM0112176 abbiamo esaminato una serie di attività cellulari potenzialmente influenzate dall’inibitore, tra cui la morfologia del citoscheletro, la concentrazione di ATP, i livelli di specie reattive dell’ossigeno (ROS), il potenziale di membrana mitocondriale e le rotture del DNA a doppio filamento (DSB). La manifestazione più pronunciata dell’azione dell’inibitore è stata la completa scomparsa delle fibre di stress F-actina nel cancro ma non nelle cellule normali dopo 24 ore di incubazione con l’inibitore (Fig. 1e). Intrigante, l’inizio della rottura dell’actina polimerica è stato molto più veloce (<5 min) (Fig. S3a supplementare) rispetto alla completa inibizione di ALDOA in vitro (∼15 min). Questo supporta l’ipotesi che la depolimerizzazione della F-actina non dipende dall’inibizione dell’attività di ALDOA.
Insieme alla distruzione del citoscheletro, abbiamo osservato un aumento significativo dei livelli di ROS e di calcio, una diminuzione della concentrazione di ATP e del potenziale di membrana mitocondriale, così come l’induzione di rotture del DNA a doppio filamento (Fig. 2a-e). È importante notare che i cambiamenti indotti da UM0112176 nelle cellule tumorali non sono stati trasmessi (ad esempio, dal rilascio di ROS) alle cellule normali: Il trattamento con UM0112176 delle cellule KLN205 co-coltivate con normali fibroblasti umani ha elevato i livelli di ROS solo nelle cellule tumorali (Fig. S3b supplementare).
a L’effetto dell’incubazione di UM0112176 (8 ore) sui livelli di ROS nelle cellule KLN205 e NSCLC e negli astrociti; le immagini (a destra) mostrano il segnale fluorescente associato ai ROS nelle cellule KLN205. Barra = 20 µm. b L’influenza dell’inibitore sulla concentrazione di Ca2+ nelle cellule cancerose e normali. c La riduzione dei livelli di ATP cellulare dopo il trattamento con UM112176 nelle cellule cancerose e normali. I valori sono dati come media di 3 misurazioni per 3 esperimenti indipendenti e SD, *p < 0.05. d Polarizzazione della membrana mitocondriale in cellule tumorali e normali dopo il trattamento con UM0112176. Più gialli appaiono i mitocondri più alto è il rapporto tra aggregati JC-1 (rosso, polarizzazione forte) e monomeri del colorante (verde, depolarizzato). Bar = 10 µM. e L’induzione di DSB (verde) con il trattamento UM112176 (8 h) nelle cellule KLN205 e hNSCLC. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI (blu). Bar = 10 µm
I cambiamenti indotti da UM0112176 non possono essere spiegati attraverso l’inibizione della glicolisi
Per capire se i cambiamenti indotti da UM0112176 possono essere riprodotti dall’inibizione della glicolisi nelle cellule tumorali, abbiamo testato l’impatto di altri enzimi glicolitici: alizarina Red S che inibisce la fosfoglicerato mutasi (PGAM)18 e 3-PO ((2E)-3-(3-piridinil)-1-(4-piridinil)-2-propen-1-one) che blocca indirettamente l’azione della 6-fosfofrutto-2-chinasi/fruttosio-bisfosfatasi-2 (PFK-2)19. L’inibizione di PGAM ha portato ad un aumento dei ROS (Fig. S4a supplementare) senza alcun effetto sul livello di calcio citoplasmatico, mentre l’inibizione di PFK-2 ha elevato i livelli citoplasmatici di Ca2+ senza cambiamenti nei ROS (Fig. S4a supplementare, b). Inoltre, anche le cellule tumorali in rapida proliferazione (KLN205), sono state in grado di mantenere un livello costante di ATP totale (Fig. supplementare S4c, d) in presenza di questi inibitori presumibilmente utilizzando altri nutrienti come la glutammina piuttosto che attivare l’assorbimento del glucosio. È importante notare che né 3-PO né Alizarin Red S hanno interrotto il citoscheletro di F-actina o indotto DSBs (dati non mostrati).
UM0112176 interrompe le interazioni ALDOA-actina
Aldolase è noto per interagire con actina e proteine leganti l’actina8,9, influenzando le dinamiche del citoscheletro. Può inibire la polimerizzazione dell’actina dipendente da WASP14 e portare a un difetto di citochinesi20 , ma può anche promuovere processi dipendenti dall’actina come la motilità delle cellule tumorali acquisita nella transizione EMT21. Questo ruolo complesso di ALDOA evoca l’ipotesi che il legame di UM0112176 a ALDOA possa essere responsabile dell’alterazione osservata del citoscheletro di F-actina.
L’interruzione del citoscheletro è, tuttavia, actina isoforma-specifica come UM0112176 parzialmente interrotto l’associazione di ALDOA con la forma fibrillare di actina citoscheletrica contenente β e γ isoforme (Fig. 3a), mentre non ha alcun effetto sulla stabilità del muscolo (α isomero) polimeri di actina (dati non mostrati). Nei rafts di F-actina-aldolasi, i contatti della F-actina con l’aldolasi si trovano principalmente in due loci; la regione dei residui 1-8 e i residui 350-36522. Le sonde antigeniche hanno localizzato siti di legame stretti per l’aldolasi nelle regioni conservate C-terminali dei microfilamenti di α-actina23. Una simulazione di dinamica browniana ha trovato residui di actina simili che partecipano al legame dell’aldolasi24. Come differenze nei residui 1-8 distinguono le isoforme di actina25, la regione N-terminale di actina guida così isoforma-specifico legame con aldolase. ALDOA ha anche dimostrato di interagire preferenzialmente con l’actina γ in pulldowns cellulare di lisati di cellule di cancro del polmone26 corroborando che il contatto ALDOA con la regione N-terminale dell’actina distingue tra le isoforme di actina.
a La dissociazione parziale indotta da UM0112176 di ALDOA dai filamenti di actina β/γ in vitro. I valori sono dati come media e SD, *p < 0.05. b L’impatto di varie combinazioni di UM0112176, ALDOA e cofilina sulla depolimerizzazione dell’actina β/γ. c La dissociazione di ALDOA indotta da UM0112176 causa il raggruppamento e la depolimerizzazione della F-actina nelle cellule KLN205. d Risultato del docking di UM0112176 a ALDOA usando Autodock. L’inibitore UM0112176 e i residui C72, K293 e C338 sono mostrati in stile bastoncino, mentre il fold di ALDOA è mostrato in stile cartone animato. Tutti gli atomi di ossigeno sono colorati in rosso, il carbonio in verde, gli atomi di zolfo in giallo, e gli atomi di azoto sono colorati in blu. Le cariche sulla superficie del potenziale elettrostatico di ALDOA sono rappresentate in blu per le regioni di carica positiva e in rosso per le regioni di carica negativa. Figura elaborata con PyMol (The PyMOL Molecular Graphics System, Version 2.0 Schrödinger, LLC.) e, f Apocynin diminuisce i livelli di ROS indotti da UM0112176 nelle cellule KLN205 e hNSCLC, rispettivamente. g Il silenziamento di NOX1 diminuisce i livelli di ROS nelle cellule KLN205 trattate con UM0112176. h Il segnale fluorescente associato a NOX1 (verde) prima e dopo il suo silenziamento nelle cellule KLN205. I nuclei sono stati controcolorati con DAPI (blu). Bar = 20 µm. Il grafico a destra mostra una diminuzione della fluorescenza associata a NOX1 dopo il silenziamento. i L’apocinina protegge parzialmente l’aumento dei livelli di calcio dopo il trattamento con UM0112716. j L’effetto dell’apocinina sull’attivazione della caspasi 3. L’immagine mostra la caspasi 3 attivata (verde) nelle cellule KLN205. Barra = 20 µm. k L’apocinina previene la distruzione del citoscheletro di actina nelle cellule trattate con UM0112176. Bar = 20 µm
È interessante notare che il sito di legame di ALDOA si sovrappone al sito di legame della cofilina sull’actina27,28, una proteina nota per accelerare la depolimerizzazione delle fibre di actina29, il cui legame implica la sovrapposizione dei residui di actina N e C-terminali30. Date le grandi forme globulari di ALDOA e cofilina, l’ampia sovrapposizione apparente in actina legante siti indica la concorrenza da ALDOA e cofilina per i loci stesso legame su actina. L’incubazione di F-actina (isoforme β-γ) con entrambi ALDOA e cofilina (in concentrazioni equimolari di subunità) ha mostrato poco effetto della cofilina sulla stabilità della F-actina (Fig. 3b) indicando che ALDOA ha protetto la F-actina contro l’azione della cofilina. Questo è coerente con il legame più stretto previsto di ALDOA a F-actin23 che cofilina che ha una costante di dissociazione stimato di ∼10 μM31. La protezione in vitro da ALDOA contro la depolimerizzazione cofilina-mediata di actina è stata abolita con l’aggiunta di UM0112176 (Fig. 3b). Anche se ALDOA potrebbe interagire con cofilina in vitro, non abbiamo trovato alcuna prova per UM0112176 di perturbare questa interazione (Fig. supplementare S2b). La destabilizzazione del citoscheletro di F-actina da UM0112176 deve quindi derivare dalla dissociazione di ALDOA dai suoi loci di legame su F-actina che si sovrappone con i loci di legame cofilina, permettendo così l’attaccamento cofilina a F-actina e mediando la sua depolimerizzazione. In linea con questo, abbiamo osservato l’assenza di colocalizzazione di actina citoscheletrica e ALDOA nelle cellule KLN205 trattate con UM0112176 (Fig. 3c).
Per studiare l’interazione di UM0112176 con ALDOA (PDB: 1ZAJ) è stata eseguita un’analisi cieca di docking molecolare. I calcoli con AutoDock32 hanno indicato 1 cluster di pose maggiore e 2 minori per UM0112176 su ALDOA. Il cluster maggiore conteneva 17 pose con energia di legame prevista vicino a ∼9,2 kcal/mole mentre il cluster minore aveva ogni 3 pose di energia di legame leggermente inferiore. Ispezione visiva pone la posizione superiore vicinale a Lys-293 e Cys-338 (Fig. 3d) permettendo loro rotamers di legame a idrogeno, rispettivamente con -C≡N e -Cl gruppi funzionali di UM0112176. La modifica di Cys-72 e Cys-338 sia attraverso il loro crosslinking33 che attraverso il glutatione ossidato inibisce l’attività catalitica34 attraverso la comunicazione a lungo raggio con il sito attivo ~25Å distante. L’inibizione a lungo raggio degli eventi dinamici durante la catalisi necessari per l’attività di ALDOA da parte di UM0112176, come è stato dimostrato per l’inattivazione del glutatione ossidato di ALDOA34, è coerente con la sua cinetica di inibizione. Intrigante, Lys-293 ha dimostrato di promuovere l’interazione γ-actina con ALDOA come mutazione K293A abroga il legame26. Inoltre, i residui che comprendono la cavità di legame UM0112176 si sovrappongono a quelli mostrati per raltegravir su ALDOA e il trattamento con raltegravir (100 μM) ha prolungato il tasso di sopravvivenza del mouse ∼2 volte rispetto al gruppo di controllo26 in un modello di cancro al polmone ortotopico. Noi ipotizziamo che UM0112176 sfrutti la capacità di dissociare ALDOA da β/γ actina competendo con γ-actina per l’interazione con Lys-293 su ALDOA.
Questa scoperta non spiega, tuttavia, l’assenza di azione di UM0112176 su actina citoscheletrica in cellule normali. Evidentemente, nelle cellule normali, altre proteine associate all’actina devono proteggere il citoscheletro dalla depolimerizzazione indotta dalla cofilina, ma nelle cellule tumorali, questa protezione è apparentemente difettosa. Abbiamo quindi cercato dei fattori specifici per il cancro che potessero accelerare la depolimerizzazione del citoscheletro di F-actina e che fossero capaci di indurre l’apoptosi. Abbiamo scoperto che uno dei principali effetti cellulari dell’applicazione di UM0112176 era un’intensificazione molto rapida della produzione di ROS che si verificava esclusivamente nelle cellule tumorali (Fig. 2a). Poiché l’aumento dei livelli di ROS era concomitante con la modulazione della struttura delle fibre di F-actina35, ci siamo concentrati sulle fonti di ROS associate al citoscheletro che possono essere specifiche per le cellule tumorali.
L’aumento dei livelli di ROS dopo il trattamento con UM0112176 è causato principalmente dall’attività NOX
L’ossidasi NADPH-dipendente (NOX) è una fonte significativa di ROS intracellulare che può essere regolata dal citoscheletro di actina36. È stato dimostrato che NOX1 partecipa alla transizione epitelio-mesenchimale, un processo che facilita l’invasione delle cellule tumorali37. Così, abbiamo ipotizzato che UM0112176 indotto spostamento di ALDOA da actina polimerizzata abilitato cofilina-diretto destabilizzazione del citoscheletro e che conseguente depolimerizzazione può essere responsabile dell’aumento ROS. È interessante notare che nella maggior parte delle cellule tumorali, le proteine NOX (specialmente l’isoforma NOX1) sono espresse a un livello più alto che nelle cellule normali38 (Fig. supplementare S2c). Così, abbiamo silenziato l’espressione di NOX1 nelle cellule tumorali (Fig. 3h) o inibito l’attività di NOX1 usando apocynin39. La risultante riduzione dell’attività e dell’espressione di NOX1 ha bloccato l’aumento indotto da UM0112176 dei livelli di ROS (Fig. 3e-g).
Questo meccanismo actino-dipendente della produzione di ROS suggerisce che UM0112176, stimolando lo spostamento di ALDOA dai filamenti di actina, permette alla cofilina di depolimerizzare i filamenti di actina e quindi di attivare NOX. La produzione di ROS da NOX attivato, a sua volta, consente l’attivazione redox di slingshot homolog 1 per de-fosforilare P-cofilina40. Infatti, l’aggiunta di UM0112176 ha ridotto i livelli cellulari di P-cofilina (Fig. supplementare S5a). ALDOA dissociato dai filamenti di actina dall’azione di UM0112176 promuove la loro ulteriore depolimerizzazione rilasciando ulteriori siti di legame per la cofilina defosforilata da legare con i filamenti. Questo meccanismo feed-forward spiegherebbe la rapida depolimerizzazione dell’actina osservata nelle cellule KLN205 e hNSCLC.
Sorprendentemente, l’apocinina ha fermato solo parzialmente l’aumento indotto da UM0112176 del livello di calcio citoplasmatico e non ha protetto dall’attivazione della caspasi 3 (Fig. 3i, j). Anche se l’apocinina ha apparentemente inibito la distruzione dei filamenti di actina da UM0112176, il citoscheletro è apparso più fitto rispetto alle cellule non trattate, e le cellule hanno mostrato una morfologia alterata quando sono state trattate contemporaneamente con apocinina e UM0112176 (Fig. 3k). La perturbazione del citoscheletro da UM0112176 o in combinazione con apocynin è coerente con la produzione di ROS dipendente da NOX1 per una corretta organizzazione del citoscheletro in queste cellule tumorali.
Meccanismo cellulare dell’azione di UM0112176 coinvolge l’apertura di mitoKATP
Una proteina che potrebbe potenzialmente collegare il citoscheletro di actina con la produzione mitocondriale di ROS e l’apoptosi è il canale mitocondriale di potassio ATP-dipendente (mitoKATP). Un legame tra la concentrazione intracellulare di K+ e l’apoptosi è stato documentato in molti sistemi e ha implicato il mitoKATP41. Il canale sembra essere sensibile alla depolimerizzazione dell’actina che aumenta la sua apertura42,43 e provoca un lieve disaccoppiamento e un aumento della produzione di ROS mitocondriale44. C’è, tuttavia, una controversia in letteratura, con alcuni risultati che suggeriscono che piuttosto la rottura dell’actina chiude mitoKATP45.
Abbiamo pretrattato le cellule tumorali con 5HD (5-idrossidecanoato), che è noto per bloccare l’apertura di mitoKATP44, e abbiamo osservato che 5HD notevolmente diminuito l’aumento UM0112176-indotta di ROS (Fig. 4a). Il pre-trattamento 5HD non è stato in grado di bloccare la distruzione del citoscheletro di actina (Fig. 4b) e l’induzione di apoptosi da UM0112176, anche se ha significativamente rallentato il tasso di attivazione della caspasi 3 (Fig. 4c). Così, la depolimerizzazione guidata da UM0112176 dell’actina citoscheletrica può essere responsabile della produzione di ROS sia attraverso l’apertura del mitoKATP sia, indipendentemente, attraverso l’attivazione di NOX1 che, a sua volta, potenzia la distruzione del citoscheletro.
a 5HD inibisce i livelli di ROS nelle cellule KLN205 trattate con UM0112176. b 5HD non protegge dalla distruzione del citoscheletro di actina indotta da UM0112176 (verde). c Diminuzione dell’attivazione della caspasi 3 (verde) nelle cellule pretrattate con 5HD prima dell’incubazione con UM0112176. d, e Afflusso di Ca2+ da fonti esterne dopo la stimolazione con UM0112176 delle cellule KLN205 e hNSCLC, rispettivamente. f, g L’effetto dell’inibizione del canale mitoKATP sull’aumento indotto da UM0112176 nelle cellule KLN205 e hNSCLC, rispettivamente. h La riduzione dell’afflusso di calcio indotto da UM0112176 dopo l’inibizione di NCX nelle cellule KLN205. i L’effetto di UM0112176 sulle interazioni HK2 (verde) con i mitocondri (magenta) nelle cellule KLN205 e nelle cellule normali HL-1. Per visualizzare meglio i cambiamenti nella localizzazione di HK2 nelle cellule KLN205 (il lato sinistro del pannello i), il canale verde (HK2) è presentato separatamente dalla fusione dei canali magenta (mitocondri) e blu (nuclei). Per le cellule HL-1, il colore bianco indica la localizzazione di HK2 colorato di verde e mitocondri color magenta. Bar = 20 µm
La modalità inversa dello scambiatore sodio-calcio è responsabile dell’afflusso di calcio indotto da UM0112176
UM0112176 legato a ALDOA era anche associato a un aumento significativo del livello di calcio cellulare nel cancro ma non nelle cellule normali (Fig. 2b). Questo aumento è stato più rapido in KLN205 (< 5 min) che nelle cellule hNSCLC (~20 min) (Fig. S4g). Noi, quindi, abbiamo cercato l’origine di questo calcio e abbiamo scoperto che proveniva dal deposito extracellulare (Fig. 4d, e). La deplezione di Ca2+ dal mezzo di coltura ha impedito l’aumento di calcio cellulare indotto da UM0112176.
Abbiamo quindi chiesto se NOX1 e mitoKATP potessero regolare sinergicamente i cambiamenti del livello di Ca2+ libero intracellulare. Infatti, l’inibizione di NOX1 ha parzialmente protetto dall’aumento di Ca2+ indotto da UM0112176 (Fig. 3i), mentre l’inibizione dell’apertura di mitoKATP ha praticamente abolito l’aumento (Fig. 4f, g). Poiché nessuna delle due proteine funziona come canale o scambiatore di calcio, devono funzionare come regolatori (ad esempio, tramite ROS) di proteine direttamente coinvolte nell’omeostasi del calcio.
L’attivazione di NOX può portare all’apertura del mitoKATP che, a sua volta, può stimolare indirettamente la modalità inversa dello scambiatore sodio-calcio (NCXrev), promuovendo l’afflusso di Ca2+ nelle cellule46. Così, abbiamo testato un possibile coinvolgimento di NCX nell’aumento di calcio indotto da UM0112176. Infatti, inibizione del NCXrev da KB-R794346 ridotto l’afflusso di calcio (Fig. 4h). Tuttavia, questo non ha impedito l’induzione dell’apoptosi (Fig. supplementare S5b).
È stato dimostrato che la depolimerizzazione dell’actina stimola l’attività di NCXrev47 che dà un ulteriore supporto per NCX come lo scambiatore responsabile dell’afflusso di Ca2+ dopo l’aggiunta di UM0112176.
Pertanto, si può concludere che il crosstalk tra NOX e ROS mitocondriale48 attiva i trasportatori di membrana, lo scambiatore sodio/idrogeno e il cotrasportatore sodio/bicarbonato attraverso la stimolazione della cascata MAPK sensibile ai ROS e culmina nell’afflusso di Ca2+ attraverso NCXrev49. Inoltre, il sovraccarico citoplasmatico di Ca2+ attiva NOX50 e il carico mitocondriale di Ca2+ attraverso l’uniportatore mitocondriale di calcio accelera la produzione mitocondriale di ROS51, creando così un ciclo di feed-back positivo che mantiene elevati livelli di ROS e di calcio e induce l’apoptosi. La soppressione dell’afflusso di Ca2+ tramite l’inibizione del NCXrev (Fig. 4h) supporta la nozione che l’apertura del mitoKATP che porta al rilascio di ROS nel citoplasma52 costituisce l’evento cruciale responsabile dell’apoptosi.
La diminuzione specifica per le cellule tumorali dei livelli di ATP dopo l’inibizione di ALDOA induce una rapida dissociazione di HK2 dai mitocondri
Anche se UM0112176 ha inibito la sintesi di ATP in tutte le linee cellulari, i cambiamenti di ATP erano più grandi e più rapidi nelle cellule tumorali (Fig. 2c). È importante notare che nelle cellule normali, ma non in quelle tumorali, questi cambiamenti erano reversibili al ritiro dell’inibitore (Fig. S4e supplementare). L’aggiunta di UM0112176 ha indotto un rapido declino (<5 min) nei livelli di ATP nelle cellule KLN205 (∼40% declino) e hNSCLC (∼20% declino) (Fig. S4f) mentre tali cambiamenti non sono stati osservati nelle cellule normali (Fig. S4f).
Questa cinetica bifasica della deplezione di ATP indotta da UM0112176 ha sollevato la questione del meccanismo responsabile della rapida diminuzione dei livelli di ATP nelle cellule tumorali. Pertanto, abbiamo esaminato la localizzazione subcellulare dell’esochinasi 2 (HK2) la cui espressione è elevata nella maggior parte delle cellule tumorali e che richiede l’associazione con i mitocondri per la piena attività e la sintesi efficiente di ATP da parte dei mitocondri4,5. Abbiamo osservato che nel cancro, ma non nelle cellule normali, HK2 dissociato rapidamente dai mitocondri dopo il trattamento UM0112176 (Fig. 4i) e la durata di questi cambiamenti è stata correlata con la scala temporale della produzione di ROS. Così, nelle cellule tumorali in rapida proliferazione, la prima fase della diminuzione UM0112176-dipendente dei livelli di ATP correla con la rapida dissociazione di HK2 dai mitocondri.
Il silenziamento dell’espressione ALDOA (Fig. supplementare S5c) ha ricapitolato le osservazioni indotte dal trattamento UM0112176 (Fig. supplementare S5d-f) e non ha mostrato una concomitante diminuzione dei livelli di ATP, in accordo con i risultati riportati da Lew e Tolan14,20. Questo sostiene che la diminuzione osservata dei livelli di ATP non è una conseguenza di una minore attività metabolica, ma ha origine da interazioni lunari di ALDOA con i suoi partner di legame che sono abrogati da UM0112176. Chang et al. ha sottolineato che la mutazione ALDOA di K293A influenza l’interazione ALDOA con γ-actina ma non comporta cambiamenti nel flusso glicolitico26 sostenendo la nostra interpretazione che UM0112176 interferisce con le interazioni moonlighting di ALDOA.
L’effetto di UM0112176 sulle cellule tumorali non può essere spiegato dall’accumulo di FBP
Per verificare se i cambiamenti osservati sono associati alla funzione non metabolica di ALDOA o se erano conseguenze dell’inibizione dell’attività enzimatica e quindi dell’accumulo di FBP, abbiamo esaminato l’effetto di FBP sul livello di ROS e ATP e sulla struttura del citoscheletro. Anche se l’efficienza della diffusione transmembrana di FBP è relativamente bassa, può essere attivamente ed efficacemente trasportata da una varietà di cellule53,54. Abbiamo osservato che 20 mM ma non 5 mM FBP extracellulare ha stimolato la produzione di ROS e destabilizzato la struttura del citoscheletro nelle cellule tumorali (Supplementary Fig. S3c, d) che è coerente con la comunicazione a lungo raggio tra il sito attivo aldolasi e UM0112176 locus legame. Le stesse concentrazioni di FBP hanno avuto solo un effetto minore sulle cellule normali (Fig. S3c, d), rispecchiando la tendenza osservata per il trattamento cellulare con UM0112176. La mancanza di cambiamenti discernibili negli astrociti concorda con l’assenza virtuale di NOX1 in queste cellule (Fig. supplementare S2c) e rafforza l’importanza della produzione di ROS da parte di NOX1 nelle cellule tumorali per una corretta organizzazione citoscheletrica. Anche se la presenza di bassi livelli di NOX1 in cellule normali che non subiscono l’apoptosi quando trattate con UM0112176 potrebbe sostenere contro NOX1 conferendo selettività delle cellule tumorali durante il trattamento UM0112176, è stato dimostrato che i mezzi di coltura a basso glucosio (5 mM) hanno impedito l’isoforma NOX4 dal targeting ai rafts lipidici negli adipociti mantenendolo in una frazione di membrana a bassa attività55. Poiché i nostri esperimenti di coltura cellulare sono stati condotti utilizzando concentrazioni di glucosio che modellano l’ambiente fisiologico (5 mM), la presenza di NOX1 nelle cellule normali serve probabilmente qualche altra funzione non citoscheletrica.
UM0112176 impedisce la localizzazione nucleare di ALDOA
Inaspettatamente, il trattamento UM0112176 ha anche portato alla deplezione di ALDOA dai nuclei delle cellule tumorali (Fig. supplementare S5g). Localizzazione nucleare ALDOA ha dimostrato di essere associato con la progressione del ciclo cellulare17, tuttavia, il meccanismo di trasporto nucleare ALDOA e il suo significato per la regolazione del ciclo cellulare richiede ulteriori studi.