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Nell’autunno del 2018, un team di ricercatori del Weizmann Institute of Science in Israele ha pubblicato i risultati che un cocktail di 11 ceppi di Lactobacillus e Bifidobacterium aveva un impatto immediato minimo e nessun effetto duraturo sulla composizione del microbioma intestinale di topi o persone. Infatti, i batteri probiotici non sono stati trovati in nessuno dei quattordici partecipanti adulti dopo la fine dell’integrazione.

Queste recenti scoperte hanno ricevuto un sacco di stampa e aggiunto al crescente sentimento tra il pubblico che i probiotici – microorganismi vivi che si presume conferiscano benefici all’ospite umano – non funzionano. Decenni di ricerche hanno dimostrato che la maggior parte dei probiotici non sono in grado di colonizzare o esercitare benefici duraturi nell’intestino umano. Alcuni critici hanno persino suggerito che i probiotici potrebbero non essere una strada promettente per trattare le malattie o migliorare la salute e il benessere. Ma noi abbiamo pensato: “Non buttate via il bambino con l’acqua sporca – il nostro lavoro dimostra che il probiotico giusto può funzionare nell’intestino dei bambini”. I risultati che abbiamo pubblicato nel 2017 hanno mostrato che nutrire i bambini allattati al seno con un probiotico che includeva un ceppo specifico di Bifidobacterium longum sottospecie infantis (B. infantis EVC001) ha portato a un aumento medio di 10.000.000 di volte nei livelli fecali di B. infantis. Questo livello persisteva per un mese dopo il consumo del supplemento, e i livelli sono rimasti elevati fino a un anno dopo il trattamento.

Per capire perché il microbioma intestinale infantile è cambiato così drasticamente nel secolo scorso, abbiamo cercato di capire come si forma il microbioma intestinale infantile.

La colonizzazione dell’intestino infantile da parte di B. infantis ha avuto effetti protettivi, come livelli più bassi di potenziali patogeni intestinali e di endotossina fecale, un componente della membrana esterna degli organismi Gram-negativi noti per scatenare l’infiammazione. Abbiamo anche scoperto che i bambini a cui è stato dato il probiotico B. infantis avevano un’infiammazione intestinale ridotta rispetto ai bambini allattati al seno che non hanno ricevuto il probiotico. I microbiomi intestinali dei bambini integrati con B. infantis ospitavano meno geni di resistenza agli antibiotici – un segno di un minor numero di patogeni – e mostravano meno degradazione della mucina, una glicoproteina secreta dall’epitelio intestinale che protegge le cellule epiteliali dal contatto diretto con i microbi intestinali. Questi dati supportano i risultati precedenti da Mark Underwood e colleghi presso l’Università della California, Davis. Nel 2013, il team di Underwood ha dimostrato che l’alimentazione di neonati pretermine un ceppo diverso, B. infantis ATCC15697, ha portato a maggiori aumenti di Bifidobacterium fecale e ridotti livelli di potenziali patogeni rispetto ai neonati dato un probiotico contenente B. lactis.

Mentre la comunità scientifica e il pubblico erano alle prese con ripetute scoperte che gli integratori probiotici presi dagli adulti non sono coerenti nel colonizzare efficacemente l’intestino o nel conferire benefici, ora avevamo prove convincenti che i microbiomi intestinali dei bambini rispondevano incredibilmente bene a specifici ceppi di B. infantis. La domanda era perché.

Le origini del microbioma

I suggerimenti sul microbioma infantile possono essere trovati in articoli centenari sui batteri commensali nelle feci dei bambini. W. R. Logan, un patologo clinico presso il Research Laboratory del Royal College of Physicians di Edimburgo, fu il primo a riferire, 100 anni fa, che i batteri negli strisci fecali dei neonati allattati al seno erano una quasi monocultura di Bacillus bifidus, che oggi è conosciuto come il genere Bifidobacterium. Gli strisci fecali di neonati nutriti con formula di quel tempo, al contrario, avevano una diversità di batteri, con relativamente pochi Bifidobacterium, più simile alla diversità microbica trovata nei neonati allattati al seno di oggi.

Questi cambiamenti sorprendenti nella composizione del microbioma intestinale visto nel secolo scorso erano coerenti con la nostra recente scoperta che il pH fecale nei neonati allattati al seno drammaticamente aumentato da pH 5.0 a 6.5 negli ultimi 100 anni, un cambiamento associato a un’apparente perdita generazionale di Bifidobacterium e concomitante aumento dei potenziali patogeni. La riduzione del Bifidobacterium nel microbioma intestinale dei neonati allattati al seno è probabilmente una conseguenza involontaria di pratiche mediche che possono salvare la vita ma non supportano la crescita del Bifidobacterium. Tali pratiche mediche includono il trattamento con antibiotici a cui il Bifidobacterium è sensibile; latte artificiale che non fornisce il cibo specifico che il batterio richiede; e un maggior numero di parti cesarei, che bypassano il percorso con cui il batterio viene trasferito dalla madre al bambino. Queste pratiche mediche sono state implicate nell’aumento del rischio di malattie allergiche e autoimmuni prevalenti nelle nazioni ricche di risorse. La riduzione di Bifidobacterium e l’aumento di microbi proinfiammatori nella prima infanzia è proposto di verificarsi durante la finestra critica di sviluppo del sistema immunitario, e quindi può aumentare il rischio di malattie immunitarie più tardi nella vita.

Per capire perché il microbioma intestinale bambino cambiato così drasticamente nel secolo scorso, abbiamo cercato di capire come questa comunità si forma. La colonizzazione del microbioma intestinale infantile inizia al momento del parto con l’esposizione ai microbi materni, soprattutto vaginali e fecali per i bambini nati per via vaginale o prevalentemente ai microbi della pelle, della bocca e dell’ambiente circostante nei bambini nati con parto cesareo. Dopo la nascita, i neonati sono bombardati da una vasta gamma di microbi che si trovano nell’ambiente, compreso il latte materno, ma le specie che diventano membri durevoli della comunità microbica sono spesso quelle trasmesse dalle madri dei neonati attraverso il contatto fisico.

I bambini continuano ad acquisire specie del microbioma intestinale dalle loro madri e da altri membri della comunità durante la prima vita. Questo è in contrasto con il microbioma intestinale di un adulto, che è stabile e resiste al cambiamento in gran parte perché lo spazio disponibile e il cibo sono già utilizzati da microbi stabiliti – le nicchie ecologiche sono semplicemente occupate nelle budella degli adulti. Quindi, ha senso che un probiotico abbia una migliore possibilità di persistere nell’intestino del bambino, dove affronta meno concorrenza, e quindi ha più probabilità di avere cibo che può consumare e una posizione dove può crescere. Un probiotico serve solo come un’ulteriore fonte di esposizione a nuovi batteri per il bambino.

Riconoscendo questo, abbiamo iniziato a chiederci: Nei nostri studi, quale nicchia ecologica ha riempito B. infantis che ha sostenuto la sua persistenza nei bambini per molto tempo dopo la cessazione della somministrazione di probiotici?

Il microbioma infantile che cambia

Storicamente, il microbioma intestinale dei bambini allattati al seno era una quasi monocultura di Bifidobacterium (J Pathol Bacteriol, 18:527-51, 1913). Il microbioma intestinale dei neonati nutriti con formula era molto più vario. Il microbioma intestinale dei bambini allattati al seno e il microbioma intestinale dei bambini allattati con la formula sono ora più simili al microbioma storico dei bambini allattati con la formula, anche se i moderni bambini allattati al seno hanno più Bifidobacterium dei moderni bambini allattati con la formula.

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Setting the stage

Un fattore importante nel determinare quali batteri prosperano nell’intestino è la disponibilità delle loro fonti alimentari di carboidrati. Quindi, affinché un probiotico funzioni in un neonato, i microrganismi dovrebbero essere selezionati in modo che la fonte di cibo che utilizzano in modo più efficiente corrisponda a ciò che è disponibile – un cibo presente e non già consumato da altri batteri. Abbiamo deciso di determinare quali carboidrati B. infantis consuma nell’intestino dei bambini.

Naturalmente, ci siamo rivolti al latte materno, che per milioni di anni è stato l’unico alimento in grado di nutrire e proteggere esclusivamente i bambini per i primi sei mesi di vita. Il latte umano fornisce nutrienti e molecole bioattive non nutritive, tra cui carboidrati noti come oligosaccaridi del latte umano (HMO). Già a metà del 1900, Paul György, biochimico, nutrizionista e pediatra di fama mondiale dell’Ospedale dell’Università della Pennsylvania, e colleghi si riferivano inconsapevolmente agli HMO quando proposero l’esistenza di un “fattore bifidus”, qualcosa di unico nel latte materno che alimentava il Bifidobacterium. Mentre gli esseri umani non possono digerire gli HMO, si scopre che il Bifidobacterium, specialmente il B. infantis, può farlo. Nel 2007, il nostro gruppo alla UC Davis ha usato strumenti basati sulla spettrometria di massa accoppiati con la microbiologia per dimostrare che B. infantis divora gli HMO come unica fonte di energia, mentre altre specie di Bifidobacterium consumano solo alcuni HMO oltre ai carboidrati di origine vegetale, animale e dell’ospite.

Gli HMO sono una classe diversa di molecole di carboidrati complessi sintetizzati dalla ghiandola mammaria. Con circa 200 specie molecolari diverse, rappresentano il terzo componente solido più abbondante nel latte umano dopo il lattosio e il grasso. Poiché gli HMO sono complessi e variano nella struttura, sono costosi da produrre. Le attuali formule per bambini possono contenere una o due strutture HMO semplici, ma ad una frazione della concentrazione che si trova nel latte materno. Le formule per lattanti mancano dell’abbondanza e della complessità degli HMO per alimentare selettivamente i microbi intestinali benefici e per legare e neutralizzare gli agenti patogeni dell’intestino.

Le specie batteriche dell’intestino infantile capaci di consumare gli HMO possono essere considerate il microbioma orientato al latte (MOM). Anche se B. infantis sembra essere il consumatore più efficiente di HMO, altre specie di Bifidobacterium, in particolare B. breve e B. bifidum, possono consumare alcuni HMO ma consumano anche carboidrati di origine vegetale, animale e dell’ospite. Le specie di Bifidobacterium che colonizzano l’intestino cambiano durante la vita in risposta ai carboidrati disponibili nella dieta dell’ospite. Per esempio, B. infantis, B. breve e B. bifidum sono bifidobatteri MOM che si trovano tipicamente nelle feci dei bambini allattati esclusivamente al seno, mentre B. longum e B. adolescentis, che consumano preferibilmente carboidrati di origine vegetale e animale, si trovano tipicamente nelle feci degli adulti. Eppure c’è variazione e sovrapposizione nelle specie presenti nelle diverse fasi della vita.

Un fattore importante nel determinare quali batteri prosperano nell’intestino è la disponibilità della loro fonte alimentare di carboidrati.

Tra i bifidobatteri MOM trovati nel microbioma intestinale dei bambini, specie diverse possono avere implicazioni diverse per il microbioma. Ad esempio, quando abbiamo dato ai neonati allattati esclusivamente al seno un supplemento con il probiotico B. infantis EVC001, il loro intestino è diventato dominato dal genere Bifidobacterium verso l’80 per cento di abbondanza relativa del microbioma intestinale e i potenziali patogeni hanno costituito meno del 10 per cento della comunità. D’altra parte, i microbiomi intestinali dei neonati allattati esclusivamente al seno che non sono stati integrati con B. infantis EVC001 avevano livelli molto più bassi di Bifidobacterium, con solo circa il 30 per cento di abbondanza relativa, e potenziali patogeni costituiva circa il 40 per cento dei microbi nel loro intestino, risultati che sono coerenti con il lavoro precedente dal nostro gruppo e altri. Questa quasi-monocultura di Bifidobacterium sembrava essere guidato da B. infantis, che rappresentava circa il 90 per cento del Bifidobacterium totale in bambini alimentati il probiotico. Al contrario, B. longum era il Bifidobatterio intestinale predominante nel gruppo di controllo, seguito da B. breve e B. bifidum. Questi dati evidenziano l’importanza vitale della specificità del ceppo nei probiotici e la combinazione della presenza di B. infantis e dell’allattamento al seno per sostenere un ambiente intestinale protettivo nei neonati.

Per capire come il B. infantis supplementare possa superare con successo altri microbi nell’intestino del bambino, abbiamo fatto un’immersione profonda nella sua strategia di alimentazione. Si è scoperto che è un mangiatore schizzinoso, che si nutre esclusivamente di HMO, e quando gli HMO sono abbondanti, B. infantis li trangugia famelicamente. A differenza di altri bifidobatteri MOM, B. infantis possiede tutti i geni necessari per la completa degradazione interna degli HMO e usa preferenzialmente gli HMO rispetto a qualsiasi altra fonte di carboidrati. Altri bifidobatteri MOM come B. bifidum e B. breve mostrano capacità di crescita solo con un sottoinsieme di HMO. B. infantis ha quindi un vantaggio competitivo quando il latte materno costituisce l’intera dieta.

Uno studio del 2008 dei colleghi della UC Davis e dei loro collaboratori ha mostrato come B. infantis fa un uso rapido degli HMO: con proteine leganti per afferrare gli HMO dal lume intestinale e trasportatori per portarli nel citoplasma, scomponendoli in monosaccaridi che vengono poi fermentati in lattato e acetato di acidi grassi a catena corta che vengono secreti dalla cellula. Questi prodotti finali mantengono un pH più basso nel milieu intestinale, favorendo il trasporto di questi composti nell’epitelio intestinale per l’uso da parte dell’ospite e creando un ambiente indesiderato per i potenziali patogeni. La produzione di acetato blocca anche l’infiltrazione di molecole tossiche prodotte da batteri patogeni migliorando la funzione della barriera intestinale e inibendo le risposte pro-infiammatorie e apoptotiche. Recenti risultati di uno studio in vitro hanno dimostrato che la quantità di acetato e lattato prodotta da diverse specie di bifidobatteri dipende da quanto bene consumano i carboidrati a loro disposizione. Quindi, alimentate un microbo che consuma carboidrati con il suo carboidrato preferito, ed esso ha un maggiore potenziale di produrre più dei suoi prodotti finali protettivi.

Un altro motivo per cui B. infantis supera gli altri ceppi bifidobatterici nell’intestino dei bambini allattati al seno è che tutta la sua digestione HMO avviene all’interno della cellula batterica. B. bifidum, invece, digerisce gli HMO esternamente. Questa digestione extracellulare libera carboidrati semplici e può alimentare trasversalmente altre specie di Bifidobacterium, ma si nutre anche trasversalmente e quindi apre una nicchia ecologica per altri microbi, forse meno benefici. L’alimentazione incrociata tra i microbi diversifica il microbioma intestinale, che è considerato generalmente benefico negli adulti.

Ma c’è un vantaggio nell’avere una quasi monocultura di Bifidobacterium nei neonati? Ponendoci questa domanda, la nostra attenzione si è rivolta allo sviluppo immunitario.

Il microbioma orientato al latte Gli oligosaccaridi del latte umano (HMO) sono carboidrati complessi che le specie microbiche del microbioma orientato al latte (MOM) possono utilizzare come fonte alimentare. Il Bifidobacterium infantis codifica molte proteine che legano e trasportano specificamente tutti i tipi di HMO nella sua cellula e li digerisce internamente. Altre specie di Bifidobacterium digeriscono solo alcuni HMO e alcuni lo fanno esternamente. La digestione degli HMO da parte di MOM Bifidobacterium si traduce nella produzione di lattato e dell’acetato di acidi grassi a catena corta, che vengono secreti nel lume intestinale. Queste molecole abbassano il pH nel milieu intestinale, il che migliora il loro trasporto nell’epitelio per l’uso da parte dell’ospite e crea un ambiente indesiderato per potenziali patogeni come l’E. coli. © laurie o’keefe
© laurie o’keefe	B. infantis consuma preferibilmente tutte le specie HMO rispetto a qualsiasi altra fonte di carboidrati. Le proteine leganti si aggrappano agli HMO e portano i carboidrati ai trasportatori che li spostano nella cellula batterica. Le glicosil idrolasi intracellulari scindono ogni legame glicosidico di tutte le strutture HMO, ottenendo monosaccaridi. Questi monosaccaridi sono metabolizzati in acetato e lattato che vengono secreti dalla cellula.
© laurie o’keefe	B. bifidum mangia solo un sottoinsieme di HMO. Le glicosil idrolasi attaccate alla membrana cellulare esterna scompongono gli HMO in mono- e disaccaridi nello spazio extracellulare. Queste molecole sono importate tramite trasportatori, e alcune sono ingerite da altri microbi intestinali, un processo chiamato cross-feeding. I mono- e disaccaridi sono ulteriormente metabolizzati in acetato e lattato, anche se, poiché B. bifidum è un consumatore meno efficiente di HMO, probabilmente produce meno di questi prodotti di B. infantis.

Benefici di un Bifidobacterium

Il declino del Bifidobacterium nel microbioma intestinale dei bambini e la disregolazione associata della comunità microbica, con più numerosi patogeni potenziali, è stato suggerito come un possibile contributo all’aumento dell’incidenza delle malattie autoimmuni che affliggono i residenti delle nazioni ricche di risorse. Al contrario, studi osservazionali hanno dimostrato effetti immunitari benefici di avere un microbioma fecale dominato da Bifidobacterium. In due studi su neonati e bambini piccoli del Bangladesh, le abbondanze fecali di B. infantis e Bifidobacterium a due mesi di età erano fortemente correlate a migliori risposte vaccinali a sei mesi e due anni rispetto ai neonati non colonizzati da B. infantis o con basse abbondanze relative di Bifidobacterium.

Inoltre, i bifidobatteri hanno meno probabilità di altri microbi, specialmente i potenziali patogeni, di portare e condividere geni di resistenza antimicrobica, che possono portare a un rischio maggiore di infezioni resistenti agli antibiotici. In uno studio osservazionale di neonati del Bangladesh e della Svezia, una dominanza di Bifidobacterium intestinale è stata associata a una riduzione significativa sia del numero che dell’abbondanza di geni di resistenza agli antibiotici. Inoltre, rispetto ai neonati allattati al seno abbinati al controllo, l’integrazione con B. infantis EVC001 ha portato a una riduzione dei geni di resistenza agli antibiotici del 90 per cento, un calo in gran parte guidato da una riduzione dei livelli di Escherichia, Clostridium e Staphylococcus – batteri potenzialmente patogeni che svolgono un ruolo importante nell’evoluzione e nella diffusione dei geni di resistenza agli antibiotici.

Nel tentativo di ripristinare il microbioma intestinale infantile dominato dal Bifidobacterium che era tipico dei bambini allattati al seno 100 anni fa, abbiamo deciso di condurre uno studio randomizzato e controllato utilizzando il probiotico B. infantis EVC001. Dato che non tutti i ceppi di B. infantis consumano tutti gli HMO in modo efficiente, abbiamo selezionato B. infantis EVC001 perché sapevamo che questo ceppo aveva la cassetta completa dei geni necessari per digerire completamente tutti gli HMO. Neonati sani, a termine, allattati al seno sono stati randomizzati a consumare B. infantis EVC001 per 21 giorni consecutivi a partire dal 7° giorno postnatale o a non ricevere il probiotico.

UN PROBIOTICO CHE FA SCHIFO: micrografie elettroniche a scansione di campioni fecali di neonati mostrano un grande aumento del numero di microbi Bifidobacterium in quelli trattati con un probiotico chiamato EVC001 (a destra) rispetto ai controlli (a sinistra).

PEDIATR RES, 86:749-57, 2019

Rispetto ai neonati di controllo allattati al seno che non hanno ricevuto il probiotico, l’integrazione ha portato a un aumento medio di 10.000.000 di volte nei livelli di B. infantis fecale e ha aumentato il Bifidobacterium fecale del 79% durante il periodo di integrazione, e questo era ancora vero a un mese post integrazione. Questo significa che la colonizzazione di Bifidobacterium persisteva senza la continuazione dell’integrazione probiotica. Inoltre, la colonizzazione di B. infantis persisteva fino a un anno di età se i bambini continuavano a consumare latte materno e non erano esposti ad antibiotici. È importante notare che i bambini integrati hanno mostrato una riduzione dell’80% dei potenziali patogeni intestinali appartenenti alle famiglie Enterobacteriaceae e Clostridiaceae e una ridotta endotossina fecale. Inoltre, abbiamo visto un aumento di 2 volte del lattato e dell’acetato fecali e una diminuzione di 10 volte del pH fecale. I microbiomi intestinali e la biochimica dei neonati integrati assomigliavano alle norme osservate un secolo fa.

Abbiamo anche identificato alcuni indizi sulle conseguenze della “modernizzazione” del microbioma intestinale. I bambini allattati al seno con basso Bifidobacterium fecale avevano escreto 10 volte più HMO nelle loro feci durante il periodo di studio di due mesi rispetto ai bambini integrati con B. infantis EVC001, indicando che gli HMO – il terzo componente più abbondante nel latte materno – stavano andando sprecati. Abbiamo anche scoperto che i neonati con basso Bifidobacterium fecale avevano livelli più alti di citochine proinfiammatorie fecali rispetto ai neonati il cui microbioma intestinale era dominato da Bifidobacterium dopo l’integrazione con B. infantis EVC001.

Insieme, questi dati dimostrano che questo particolare ceppo di B. infantis, fornito come probiotico ai neonati allattati al seno, ha colonizzato drasticamente il microbioma intestinale dei neonati durante e dopo l’integrazione, e ha rimodellato in modo benefico l’ambiente microbico, biochimico e immunologico dell’intestino dei neonati. Molti neonati in tutto il mondo non acquisiscono mai B. infantis, ma la combinazione di allattamento al seno e integrazione probiotica con questo batterio sembra portare a un ambiente intestinale nutriente e protettivo.

Molti bambini nel mondo non acquisiscono mai B. infantis, ma la combinazione di allattamento al seno e integrazione probiotica con questo batterio sembra portare a un ambiente intestinale nutriente e protettivo.

I nostri risultati supportano anche l’ipotesi che l’inefficacia di alcuni probiotici negli adulti sia dovuta in parte al fatto che stanno introducendo una nuova specie in una comunità consolidata con poche nicchie ecologiche ancora aperte. I probiotici possono non funzionare nei neonati quando c’è una mancata corrispondenza tra le esigenze di carboidrati del probiotico e la disponibilità di carboidrati altamente specifici come gli HMO nel latte materno. Poiché B. infantis consuma in modo efficiente quasi tutti gli HMO che si trovano nel latte materno, è probabile che trovi una nicchia ecologica aperta e quindi superi altri microbi, in particolare gli agenti patogeni proinfiammatori.

Molti scienziati stanno lavorando per capire cosa significa davvero il microbioma intestinale dei neonati per la salute nel corso della vita. Nel frattempo, stiamo rivolgendo la nostra attenzione ad altre domande: Come differiscono i modelli di colonizzazione del Bifidobacterium nelle popolazioni infantili di tutto il mondo dall’infanzia allo svezzamento? E quali alimenti solidi supportano un intestino sano e un sistema immunitario? Lavorando con il finanziamento del National Institutes of Health, stiamo ora conducendo uno studio progettato per capire come le strutture dei carboidrati degli alimenti complementari influenzano la funzione microbica che sosterrà un microbioma intestinale sano e lo sviluppo del sistema immunitario nella tarda infanzia e nella prima infanzia. L’obiettivo finale è quello di identificare specifiche strutture di carboidrati nella dieta che alimentano selettivamente i microbi intestinali benefici nei bambini durante la finestra critica dello sviluppo immunitario per la salute di tutta la vita.

Jennifer Smilowitz è il direttore associato del programma di ricerca sugli studi umani presso il Foods for Health Institute e uno scienziato ricercatore presso il dipartimento di scienza e tecnologia alimentare dell’Università della California, Davis. Diana Hazard Taft è un ricercatore post-dottorato nel laboratorio di David Mills nel Dipartimento di Scienze e Tecnologie Alimentari e un membro dell’Istituto Alimenti per la Salute della UC Davis.