Riproduci media
Il principio di base per rendere visibili i cambiamenti di fase nella microscopia a contrasto di fase è quello di separare la luce illuminante (sfondo) dalla luce diffusa dal campione (che costituisce i dettagli in primo piano) e di manipolarli diversamente.
La luce illuminante ad anello (verde) che passa l’anello del condensatore viene focalizzata sul campione dal condensatore. Una parte della luce illuminante viene diffusa dal campione (giallo). La luce rimanente non è influenzata dal campione e forma la luce di fondo (rosso). Quando si osserva un campione biologico non colorato, la luce diffusa è debole e tipicamente sfasata di -90° (a causa dello spessore tipico dei campioni e della differenza di indice di rifrazione tra il tessuto biologico e il mezzo circostante) rispetto alla luce di fondo. Questo porta il primo piano (vettore blu) e lo sfondo (vettore rosso) ad avere quasi la stessa intensità, con conseguente basso contrasto dell’immagine.
In un microscopio a contrasto di fase, il contrasto dell’immagine viene aumentato in due modi: generando un’interferenza costruttiva tra i raggi di luce diffusa e di sfondo nelle regioni del campo visivo che contengono il campione, e riducendo la quantità di luce di sfondo che raggiunge il piano dell’immagine. In primo luogo, la luce di fondo viene sfasata di -90° facendola passare attraverso un anello di sfasamento, che elimina la differenza di fase tra lo sfondo e i raggi di luce diffusa.
Quando la luce viene messa a fuoco sul piano dell’immagine (dove è posizionata una telecamera o un oculare), questo spostamento di fase fa sì che i raggi di luce di fondo e quelli sparsi provenienti dalle regioni del campo visivo che contengono il campione (cioè, il primo piano) per interferire costruttivamente, con conseguente aumento della luminosità di queste aree rispetto alle regioni che non contengono il campione. Infine, lo sfondo è oscurato ~70-90% da un anello di filtro grigio; questo metodo massimizza la quantità di luce diffusa generata dalla luce di illuminazione (cioè, sfondo), riducendo al minimo la quantità di luce di illuminazione che raggiunge il piano di immagine. Una parte della luce diffusa che illumina l’intera superficie del filtro sarà sfasata e oscurata dagli anelli, ma in misura molto minore rispetto alla luce di fondo, che illumina solo gli anelli del filtro grigio e sfasato.
Quanto sopra descrive il contrasto di fase negativo. Nella sua forma positiva, la luce di fondo è invece sfasata di +90°. La luce di fondo sarà quindi fuori fase di 180° rispetto alla luce diffusa. La luce diffusa sarà quindi sottratta dalla luce di fondo per formare un’immagine con un primo piano più scuro e uno sfondo più chiaro, come mostrato nella prima figura.