Metodi
Dopo l’approvazione del protocollo da parte dell’Ethical Review Board del Leiden University Medical Centre, è stato chiesto a 25 soggetti maschi e femmine sani (età 18-45 anni) di partecipare a questo studio esplorativo. Dopo aver dato il consenso informato scritto, i soggetti hanno ricevuto un esame medico completo prima di entrare nello studio, compreso un test di gravidanza per le partecipanti femminili in età fertile. L’uso di alcol e xantine è stato limitato a due unità al giorno, da due giorni prima del giorno dello studio. Inoltre, i soggetti si sono astenuti da alcol, caffeina e cibi e bevande contenenti xantina 12 ore prima dei giorni di studio e durante i giorni di studio. I soggetti di sesso femminile sono stati istruiti ad usare contraccettivi di barriera. Durante il periodo di studio non erano permessi altri farmaci oltre al paracetamolo.
Questo era uno studio in doppio cieco, parzialmente randomizzato, controllato con placebo, a dosi ascendenti di GPI 5693, con periodi minimi di washout di 48 ore. Lo studio mirava a raggiungere una concentrazione massima (Cmax) e un’area sotto la curva di concentrazione (AUC) alle concentrazioni che mostrano l’inversione dell’iperalgesia nei modelli animali sperimentali.
Lo studio è stato eseguito in pannelli, con analisi intermedie di farmacocinetica e sicurezza per adattare il disegno dei pannelli consecutivi. Quattro soggetti maschi che partecipavano al pannello 1 hanno ricevuto a digiuno dosi orali di GPI 5693 di 100 mg, 300 mg e 750 mg, con un’occasione placebo inserita a caso. Un quinto giorno di studio in aperto è stato aggiunto a questo pannello per studiare gli effetti del cibo sulla dose di 750 mg. Dopo un’analisi intermedia, le dosi selezionate per il pannello 2 (che consisteva anche di quattro soggetti maschi) erano 300 mg, 750 mg, 1125 mg e placebo. Le analisi intermedie dei primi due panel hanno fornito indicazioni su un effetto del cibo sulla farmacocinetica di GPI 5693. La sicurezza e la tollerabilità del farmaco negli uomini hanno permesso l’inclusione delle donne in un terzo panel in aperto, che studiava la tollerabilità e la farmacocinetica dopo singole dosi orali di 1125 e 1500 mg in stato di alimentazione per entrambi i sessi. Nessun effetto sul sistema nervoso centrale è stato misurato durante il Panel 3 che consisteva di sei soggetti di sesso femminile e sei di sesso maschile.
La registrazione dei movimenti oculari, il tracking adattivo, l’oscillazione del corpo e le scale analogiche visive (VAS) sono stati praticati prima del primo giorno di studio per ridurre gli effetti di apprendimento durante lo studio. GPI 5693 è stato somministrato in capsule da 100 mg e 375 mg dopo il digiuno notturno. Durante tutte le occasioni dei primi due pannelli senza interazione con il cibo, EEG, movimenti oculari, tracking adattivo, ondeggiamento del corpo e VAS sono stati misurati al basale e a intervalli di 30 min per le prime 2 h, e con intervalli crescenti fino a 8 h dopo la somministrazione del farmaco. ECG, segni vitali ed eventi avversi sono stati controllati regolarmente e il monitoraggio continuo dell’ECG a due derivazioni è stato eseguito per 4 ore dopo la somministrazione del farmaco. Nel periodo di 24-48 ore dopo la somministrazione del farmaco, è stato prelevato un campione fecale per verificare la presenza di sangue occulto. Il campionamento del sangue per i parametri ematologici e biochimici è stato fatto al basale e 24 ore dopo la somministrazione. Il campionamento farmacocinetico è stato eseguito ogni 10 minuti per la prima ora e con intervalli crescenti fino a 48 ore dopo la somministrazione del farmaco. GPI 5693 è stato misurato per mezzo di LC/MS/MS. Le concentrazioni di GPI 5693 nel plasma erano lineari da 1 a 2000 ng ml-1 e le concentrazioni di GPI 5693 nelle urine erano lineari da 10 a 2000 ng ml-1. Il CV medio all’interno del test era del 2,5% e il CV medio tra i test era dell’1,6%.
I soggetti sono rimasti nel sito dello studio fino a 24 ore dopo ogni dosaggio. Un controllo post-studio ha avuto luogo 48 ore dopo l’ultimo giorno di studio, compreso il follow-up finale di eventuali effetti avversi.
Gli elettroencefalogrammi sono stati registrati e analizzati utilizzando il software CED (Cambridge Electronics Design, Cambridge, UK), come descritto in precedenza. Le registrazioni EEG sono state effettuate utilizzando elettrodi in argento-cloruro d’argento, fissati con collodio a Fz, Cz, Pz e Oz, con lo stesso elettrodo di massa comune della registrazione dei movimenti oculari (sistema internazionale 10/20). Le resistenze degli elettrodi sono state mantenute sotto i 5 kOhm. Tutte le registrazioni sono state fatte con gli occhi chiusi dei soggetti. I segnali EEG sono stati ottenuti dalle derivazioni Fz-Cz e Pz-Oz. I segnali sono stati amplificati utilizzando un amplificatore bioelettrico Nihon Kohden AB-621G (Nihon Kohden Corporation, Tokyo, Giappone) con una costante di tempo di 0.3 s e un filtro passa basso a 100 Hz. Per ogni sessione sono stati registrati otto blocchi consecutivi di 8 s su un periodo di 2 minuti. La frequenza di campionamento era 1024 Hz. I blocchi di dati contenenti artefatti sono stati identificati mediante ispezione visiva e sono stati esclusi dall’analisi. Analisi veloce trasformata di Fourier è stata eseguita per ottenere la somma delle ampiezze nel delta- (0.5-3.5 Hz), theta- (3.5-7.5 Hz), alfa- (7.5-11.5 Hz) e beta (11.5-30 Hz) gamme di frequenza. La larghezza di banda totale di registrazione era 0-50 Hz.
La registrazione e l’analisi dei movimenti oculari saccadici e di inseguimento liscio sono stati fatti con un sistema basato su microcomputer. L’attrezzatura utilizzata per la visualizzazione dello stimolo, la raccolta e l’amplificazione del segnale era della Nihon Kohden (Nihon Kohden Corporation, Tokyo, Giappone). I movimenti oculari saccadici sono stati registrati per ampiezze di stimolo di 15 gradi su entrambi i lati. Gli intervalli di interstimolo variavano in modo casuale tra 3 e 6 s, e sono state registrate 15 saccadi. I valori medi della velocità del picco saccadico, della latenza (tempo di reazione) e dell’imprecisione sono stati usati come parametri. Per i movimenti oculari di inseguimento liscio il bersaglio si è spostato sinusoidale a frequenze da 0.3 a 1.1 Hz, aumentando di passi di 0.1 Hz. L’ampiezza dello spostamento dell’obiettivo corrisponde a 20 gradi di rotazione del bulbo oculare su entrambi i lati. Quattro cicli sono stati registrati per ogni frequenza di stimolo.
Il test di tracking adattivo è stato eseguito come originariamente descritto da Borland e Nicholson, utilizzando attrezzature e software personalizzati (Hobbs, 2000, Hertfordshire, UK). Le prestazioni medie e la deviazione standard dei punteggi su un periodo di 10 minuti sono stati utilizzati per l’analisi. L’inseguimento adattivo è un compito di inseguimento. Un cerchio si muove in modo casuale sullo schermo. Il soggetto viene istruito a cercare di mantenere un punto all’interno del cerchio in movimento azionando un joystick. Se questo sforzo ha successo, la velocità del cerchio in movimento aumenta. Al contrario, la velocità si riduce se il soggetto non riesce a mantenere il punto all’interno del cerchio. Le prestazioni sono state valutate dopo un periodo fisso di 10 minuti. Il test di inseguimento adattivo è più sensibile alla compromissione della coordinazione occhio-mano da parte dei farmaci rispetto ai compiti di inseguimento compensativo o ad altri compiti di inseguimento, come il rotore di inseguimento. Il test di inseguimento adattivo ha dimostrato di essere utile per la misurazione degli effetti sul SNC dell’alcol, di vari psicofarmaci e della privazione del sonno. L’ondeggiamento del corpo è stato misurato con un apparecchio simile all’atassiametro Wright. Con una corda attaccata alla vita, tutti i movimenti del corpo per un periodo di tempo sono stati integrati ed espressi come mm di oscillazione su un display digitale. Il contributo della vista al controllo posturale è stato eliminato chiedendo ai soggetti di chiudere gli occhi. I soggetti sono stati istruiti a indossare lo stesso paio di scarpe comode e con il tacco basso in ogni sessione. Prima di iniziare una misurazione, ai soggetti è stato chiesto di stare fermi e comodi, con i piedi distanti circa 10 cm e le mani in posizione rilassata lungo il corpo. I soggetti non potevano parlare durante la misurazione. Il periodo totale di misurazione dell’ondeggiamento del corpo è stato di 2 minuti
Per quantificare gli effetti soggettivi sono state utilizzate le scale visive analogiche descritte originariamente da Norris. Da queste misurazioni, sono stati derivati tre fattori come descritto da Bond e Lader, corrispondenti alla vigilanza, all’umore e alla calma. Gli effetti psichedelici sono stati monitorati da scale analogiche visive, tradotte dalle scale descritte da Bowdle et al. poiché non era disponibile una versione convalidata per la lingua e la popolazione olandese.
Tutte le variabili dinamiche misurate ripetutamente sono state caratterizzate usando il cambiamento massimo dal valore di pretrattamento (Emax) e usando le aree sotto la curva degli effetti (AUEC). Queste AUEC sono state calcolate utilizzando la regola lineare trapezoidale e sono state divise per l’intervallo di tempo corrispondente, ottenendo un risultato medio ponderato. Sono stati utilizzati tempi nominali. Le AUEC sono state calcolate sull’intero periodo di campionamento (12 ore) e sulle prime 6 ore perché la maggior parte della risposta dovrebbe verificarsi durante questo periodo.
Sono state ottenute statistiche descrittive per ogni parametro farmacodinamico. Il corso del tempo e i parametri derivati sono stati riassunti (utilizzando media, deviazione standard (SD), min, mediana, max, n). I parametri farmacodinamici derivati sono stati analizzati non trasformati. I parametri EEG sono stati analizzati come variazione percentuale dalla prevalenza. Questi parametri sono stati analizzati, dalle sole occasioni di digiuno, utilizzando l’analisi della varianza (anova) tenendo conto del soggetto e del trattamento.
I parametri indipendenti dalla dose (Clearance, Cmax/dose, AUC0-inf/dose e tmax) sono stati confrontati tra le occasioni di digiuno e di alimentazione utilizzando l’analisi della covarianza con cibo e soggetto come fattori, dose come covariata e includendo l’interazione dose-cibo. Ciò ha portato a una relazione lineare prevista tra la dose e il parametro farmacocinetico (PK) per l’alimentazione e il digiuno separatamente. Questa linea è stata rappresentata nei grafici dei singoli parametri PK (Clearance, Cmax/dose, AUC0-inf/dose e tmax) tracciati contro la dose, per visualizzare sia la dipendenza dalla dose che le potenziali differenze tra le occasioni di digiuno e di alimentazione. La linea è stata calcolata utilizzando le medie dei minimi quadrati riportate (alla dose media somministrata: 907,5 mg) insieme alle pendenze sulla dose per i due gruppi (alimentati/digiuni). In assenza di una significativa interazione dose-cibo, il modello anova è stato ricalcolato assumendo che l’interazione sia assente e in tal caso le linee risultanti (parallele) sono mostrate nei grafici.
I calcoli statistici sono stati effettuati utilizzando SPSS per Windows (SPSS, Inc, Chicago, IL) e SAS per Windows V8.1 (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA).
I parametri farmacocinetici sono stati calcolati mediante analisi non compartimentale standard utilizzando il pacchetto software WinNonlin V3.1 (Pharsight, Inc., Mountainview, CA, USA).