Come le proteine Rb controllino la proliferazione cellulare non è completamente compreso. È stato stabilito che la proteina RB si associa con un’ampia varietà di fattori di trascrizione e complessi associati alla cromatina.
Il legame della proteina Rb inibisce la capacità di attivazione trascrizionale dei fattori E2F, mascherando il dominio di attivazione trascrizionale e, in alcuni casi, convertendo i fattori E2F in repressori della trascrizione. L’importanza dell’interazione Rb-E2F nel controllo della crescita cellulare è dimostrata dalla scoperta che tutti i mutanti Rb naturali isolati da tumori umani mancano della capacità di legare e regolare negativamente E2F (Qian et al, 1992).
Si pensa che le proteine Rb inibiscano l’espressione dei geni regolati da E2F in due modi (Dyson et al., 2002): legando direttamente e bloccando il dominio di attivazione delle proteine E2F o tramite repressione attiva attraverso il reclutamento di HDAC, fattori SWI/SNF, proteine del gruppo Polycomb (Dahiya et al., 2001) o metiltransferasi (Vandel et al., 2001).
Binding to E2F transcription factors
La famiglia dei fattori di trascrizione E2F consiste di almeno sette membri della famiglia E2F, E2F1, E2F2, E2F3, E2F4, E2F5, 2A7E e E2F7.
Un fattore di trascrizione E2F funzionale consiste in un eterodimero contenente un polipeptide E2F e un polipeptide DP (Helin et al, 1993). Ognuno dei polipeptidi E2F può eterodimerizzare con DP1 o DP2 (DP3) (Ormondroyd et al., 1995), anche se il fattore di trascrizione E2F7 si lega al DNA in modo indipendente da DP.
Ci sono differenze funzionali e strutturali nella famiglia E2F. E2F1, E2F2 e E2F3 sono attivatori trascrizionali che interagiscono con pRB. E2F4 e E2F5 sono repressori trascrizionali e legano principalmente Rb2/p130 e p107 (Gaubatz et al., 2000). 2A7E sembra non avere un dominio di interazione proteica tascabile; interagisce con le proteine Polycomb e reprime la trascrizione (Morkel et al., 1997). Le recentemente identificate E2F7 e E2F8 sono anche ritenute reprimere specifici promotori (Di Stefano et al., 2003). Il partner di eterodimerizzazione DP non sembra determinare la specificità di legame dei fattori E2F per le proteine della tasca. Tuttavia, i fattori DP funzionano nella stabilizzazione dell’interazione tra i fattori E2F e le proteine Rb (Helin et al., 1993).
Durante la risposta alla proliferazione cellulare, c’è una diversa espressione dei vari E2F, presentando un aumento di E2F3 all’inizio di G1 fino a metà G1 e con E2F1 ed E2F2 che aumentano al confine G1/S (Johnson et al., 1998). E2F4 ed E2F5 sono espressi durante tutto il ciclo cellulare, ma in G0 e all’inizio di G1, sono legati al nucleo da p107 e Rb2/p130, formando complessi repressori trascrizionali. p107 e Rb2/p130 reclutano E2F4 nei nuclei della cellula, inducendo la repressione della trascrizione dei geni della fase S e la proliferazione cellulare. Nel frattempo, si ritiene che pRb leghi E2F1-3 in corrispondenza o sequestrato lontano dai promotori che rispondono a E2F (De La Luna et al., 1996).
Dopo la stimolazione, le cellule quiescenti entrano nel ciclo cellulare, e nella fase early-G1, pRb è fosforilata e di conseguenza i fattori trascrizionali E2F1-3 sono rilasciati, mentre solo nella fase mid-G1 e late G1, possiamo osservare la perdita dei complessi Rb2/p130. Quindi, nella tarda fase G1, le proteine Rb sono fosforilate e si dissociano da E2F; E2F4 ed E2F5 si spostano nel citoplasma ed E2F1-3 si legano ai promotori E2F-rispondenti in siti che spesso sono diversi dal sito di legame delle proteine repressorie E2F (Cinti et al., 2000). Alla transizione G1/S-fase, complessi contenenti p107 in associazione con E2F4 possono ancora essere rilevati (Mudryj, 1991). Questi complessi E2F4-p107 contengono anche la ciclina E o A e cdk2 (Shirodkar, 1992). È stato anche dimostrato che i complessi E2F-p130 si accumulano quando alcuni tipi di cellule, compresi i mioblasti e i melanociti, vanno incontro a differenziazione terminale (Shin et al., 1995).
pRb e le relative proteine p107 e Rb2/p130 non hanno una funzione completamente ridondante nel regolare la trascrizione dei geni E2F; mostrano invece una grande ridondanza a livello del ciclo cellulare. Per esempio, nei fibroblasti pRb-/-, c’è un aumento compensatorio dei livelli di proteina p107 durante l’arresto in fase G0/G1 (Sage et al., 2003). Il meccanismo di questo effetto antiproliferativo di p107 è sconosciuto – p107 potrebbe sostituire pRb nella regolazione di E2F1-3 o potrebbe reprimere alcuni geni E2F-responsivi che sono controllati da pRb (Lee et al., 2002). Inoltre, pRb può anche legare E2F4 in vitro ma non riesce a regolare il promotore E2F-responsivo in cellule p107-/- e p130-/-. È stato dimostrato che il complesso pRb-E2F4, nelle cellule p107-/-, non riesce a legare gli stessi siti promotori che sono solitamente legati dal complesso p107-E2F4 nelle cellule wild-type (Rayman et al., 2002).
Tuttavia, pRb è coinvolto nella repressione di un insieme limitato di geni E2F nelle cellule G0 e G1, e recentemente è stato definito il suo ruolo nella repressione del gene della ciclina E. Il promotore della ciclina E è infatti deregolato nelle cellule che hanno perso pRb, anche se il complesso p107/p130-E2F4 è ancora disponibile (Herrera et al., 1996). pRb media la repressione del promotore della ciclina E attraverso il reclutamento di HDAC e istone metiltransferasi su un particolare sito E2F-SP1 che è legato esclusivamente dai complessi pRb-E2F1-3. La ciclina E è derepressa non solo dalla perdita di pRb ma anche dalla perdita delle proteine E2F1-3, quindi è chiaro che le proteine E2F1-3 agiscono in questo caso come repressori invece che come attivatori (Wu et al, 2001). p107 o Rb2/p130 possono sostituire pRb solo se sono presenti in quantità sufficiente per legare le proteine E2F1-3 (Lee et al., 2002).
pRb può inibire la proliferazione attraverso un meccanismo indipendente da E2F. Per esempio, pRb può indurre la formazione dei corpi nucleari della leucemia promielocitica (PML) (Fang et al., 2002), aumentare l’espressione di p27 (vedi sopra), sopprimere la segnalazione di Ras (Lee et al, 2002) e cooperano con hLin-9, una proteina che è coinvolta, in modo simile a pRb, nella soppressione della trasformazione ma in modo indipendente da E2F (Gagrica et al., 2004).
I complessi repressori RB/E2F possono anche essere regolati in modo indipendente da Cdk. Per esempio, il fattore di crescita trasformante-β recluta E2F4/p107 e E2F5/p107 dal promotore di c-myc indipendentemente dalla fase cellulare, ed è ancora stabile in presenza di un’alta attività di Cdk (Chen et al., 2004). Nelle cellule umane, è stato notato che p107 e p130 sono rimosse dai promotori dei geni regolati dal ciclo cellulare durante la fase S, ma sono ancora localizzate ai promotori dei geni apoptotici (Young et al., 2004). La regolazione del complesso RB/E2F in maniera indipendente dal Cdk non è ancora ben compresa.
Legandosi a proteine che modificano la struttura della cromatina
La repressione da parte delle proteine Rb richiede i domini A e B conservati della proteina pocket e sembra coinvolgere l’associazione di altre proteine oltre ai fattori E2F. Le proteine Rb reprimono la trascrizione rimodellando la struttura della cromatina attraverso l’interazione con proteine come hBRM, BRG1, HDAC1 e SUV39H1 (Shao et al., 1995), che sono rispettivamente coinvolte nel rimodellamento dei nucleosomi, nell’acetilazione/deacetilazione degli istoni e nella metilazione.
hBRM e BRG1 sono omologhi mammiferi dei componenti del complesso di rimodellamento della cromatina del lievito SNF2/SWI2 (Strober et al., 1996). Sia BRG1 che hBRM hanno dimostrato di associarsi a pRB e sono implicati nella repressione mediata da pRb. Un’interazione fisica tra pRb e BRG1 non è richiesta per l’arresto della crescita indotto da pRB e la repressione trascrizionale dei geni bersaglio di E2F (Kang et al., 2004).
L’istone deacetilasi 1 è una HDAC che ha recentemente dimostrato di essere reclutata nei complessi E2F da pRb e di funzionare nella repressione dell’espressione genica della ciclina E (Magnaghi-Jaulin et al., 1998). Gli istoni sono generalmente iperacetilati ai promotori dei geni attivamente trascritti, ma sono ipoacetilati ai geni silenziati. L’istone deacetilasi è generalmente reclutato sui promotori dei geni da molti regolatori trascrizionali. pRB si associa all’attività delle HDAC in vivo e si lega alle HDAC di classe I (HDAC1-HDAC3) in vitro. La repressione mediata da pRB è potenziata da HDAC1 in esperimenti di trasfezione transitoria, e per confermare questa associazione tra pRb e HDAC, è stato dimostrato che l’inibizione dell’attività HDAC con tricostatina A interferisce con la repressione mediata da pRB in un sottogruppo di promotori regolati da E2F (Zhang et al, 2000). L’istone deacetilasi è quindi coinvolto nella modulazione dell’attività repressiva di pRb sui promotori del gene E2F. Il reclutamento di HDAC può essere indiretto e accompagnato dal reclutamento di altre proteine di legame come RBP1, corepressori e proteine di rimodellamento della cromatina (Lai et al., 1999). Rayman et al. (2002) hanno dimostrato che nelle cellule Rb-/-, HDAC si trova sui promotori del gene E2F; questo ci ha permesso di ipotizzare che pRb non è strettamente necessaria nella repressione trascrizionale di E2F, ma che altri meccanismi potrebbero essere coinvolti. Le proteine istone acetiltransferasi (CCBP, p300, Tip6, ecc.) partecipano all’attivazione delle proteine E2F (Condorelli e Giordano, 1997); esse interagiscono con il dominio di attivazione delle proteine E2F e stimolano la loro attivazione.
SUV39H1 è una metiltransferasi che metila specificamente K9 dell’istone H3 e coopera con pRb nella repressione del promotore dei geni E2F-rispondenti. Nelle cellule prive di pRB, non c’è associazione di me-K9-H3 in questi promotori (Rea et al., 2000); in particolare, questi risultati sono stati sviluppati studiando la ciclina E, uno dei migliori geni bersaglio di E2F modulato da pRb. Sia pRb che SUV39H1 sono direttamente coinvolti nella repressione della trascrizione della ciclina E, poiché sia nelle cellule pRb-/- che in quelle SUV39H1-/- double knockout, la ciclina E è sovraespressa. Le proteine Rb sono anche in grado di impedire l’assemblaggio dei complessi di preiniziazione, inibendo l’attività dei fattori di trascrizione reclutati sui promotori dei geni E2F (Ross et al., 1999).
Il tipo di repressione che le proteine Rb esercitano sulla crescita cellulare dipende dal tipo di proteine corepressori che legano i geni target di E2F. Per esempio, diversi tipi di repressione trascrizionale possono operare sullo stesso promotore in un diverso stato cellulare o in un diverso fenotipo cellulare (Dimova e Dyson, 2005).
Il complesso pRb/E2F può anche promuovere una repressione stabile indipendentemente dalla posizione del ciclo cellulare o essendo resistente alla progressione del ciclo cellulare. Sfortunatamente, i meccanismi attraverso i quali pRb è coinvolto nei processi che reprimono permanentemente la trascrizione E2F-dipendente non sono ben conosciuti fino ad ora. Per esempio, E2F4 può essere trovato ai promotori regolati da E2F in fase S, ma non è chiaro se agisce come attivatore. Le cellule senescenti, per esempio, mostrano un livello più alto di metilazione H3K9 nei promotori regolati da E2F rispetto alle cellule quiescenti (Narita et al., 2003). Le proteine Rb mediano i geni E2F-responsivi sia nello stato quiescente che in quello senescente/differenziato, il primo caratterizzato da bassi livelli di metilazione di H3K9 e il secondo da alti livelli di metilazione di H3K9. L’identità dell’istone metiltransferasi che viene reclutato sul promotore può anche modulare la transizione tra una cellula quiescente e una cellula senescente/differenziata.