La spettroscopia ultravioletto-visibile, o UV-Vis, è una delle tecniche analitiche più popolari in laboratorio.
Nella spettroscopia UV-Vis, la luce viene fatta passare attraverso un campione ad una lunghezza d’onda specifica nello spettro UV o visibile. Se il campione assorbe parte della luce, non tutta la luce verrà attraversata, o trasmessa. La trasmissione è il rapporto tra l’intensità della luce trasmessa e la luce incidente, ed è correlata all’assorbanza. L’assorbanza può essere usata in modo quantitativo, per ottenere la concentrazione di un campione. Può anche essere usata in modo qualitativo, per identificare un composto facendo corrispondere l’assorbanza misurata su una gamma di lunghezze d’onda, chiamata spettro di assorbanza, ai dati pubblicati. Questo video introdurrà la spettroscopia UV-Vis e ne dimostrerà l’uso in laboratorio per determinare la concentrazione del campione e la cinetica di reazione.
Quando un fotone colpisce una molecola e viene assorbito, la molecola viene promossa dal suo stato fondamentale ad uno stato di energia superiore. La differenza di energia tra i due è il band gap. L’energia del fotone deve corrispondere esattamente al band gap affinché il fotone venga assorbito. La struttura chimica determina il band gap; quindi le molecole hanno ciascuno spettri di assorbanza unici.
L’assorbanza segue la legge di Beer, che afferma che l’assorbanza è uguale al coefficiente di attenuazione molare per la lunghezza del percorso e la concentrazione. Il coefficiente di attenuazione molare è legato alla capacità del singolo composto di assorbire la luce di una specifica lunghezza d’onda. La lunghezza del percorso si riferisce alla distanza percorsa dalla luce attraverso il campione, che è tipicamente 1 cm per le cuvette standard. La legge di Beer può essere usata per calcolare la concentrazione del campione, se l’assorbibilità è nota, o può essere usata una curva di calibrazione.
UV-Vis è spesso chiamata una tecnica generale, poiché la maggior parte delle molecole assorbono la luce nell’intervallo di lunghezze d’onda UV-visibile. L’intervallo UV si estende da 100-400 nm, e lo spettro visibile va da 400-700 nm. Tuttavia, la maggior parte degli spettrofotometri non opera nell’intervallo UV profondo di 100-200 nm, poiché le fonti di luce in questo intervallo sono costose. La maggior parte degli spettrofotometri UV-Vis utilizza una lampada al deuterio per la gamma UV, che produce luce da 170-375 nm, e una lampada a filamento di tungsteno per la gamma visibile, che produce luce da 350-2.500 nm.
Siccome la fonte di luce è di solito una lampada con ampi intervalli di lunghezza d’onda, la lunghezza d’onda di assorbanza specifica viene selezionata utilizzando filtri o un monocromatore. Un monocromatore è un dispositivo che separa spazialmente le lunghezze d’onda della luce, e poi pone una fessura di uscita dove si trova la lunghezza d’onda desiderata della luce. Il monocromatore può essere scansionato su una gamma di lunghezze d’onda per fornire un intero spettro di assorbanza. Questo rende la tecnica utile per quantificare e identificare una vasta gamma di molecole.
Ora che le basi della spettroscopia UV-Vis sono state delineate, diamo un’occhiata a un semplice esperimento UV-Vis in laboratorio.
Prima di iniziare la misurazione, accendere lo spettrofotometro e lasciare che le lampade si riscaldino per un periodo di tempo adeguato per stabilizzarle.
Preparare un vuoto riempiendo una cuvetta pulita con il solvente del campione, e poi pulire l’esterno con carta priva di lanugine per rimuovere eventuali impronte digitali.
Assicurarsi che la cuvetta è allineato correttamente con eventuali lati scanalati fuori dal percorso del fascio, e inserirlo nello spettrofotometro. Fissare il coperchio per evitare che la luce ambientale entri nel sistema.
Misurare l’assorbanza del bianco ad una lunghezza d’onda, o su un intervallo di lunghezza d’onda. Registrare o salvare l’assorbanza, in quanto deve essere sottratta dall’assorbanza del campione.
Poi, scartare il bianco e sciacquare la cuvetta due volte con il campione. Poi, riempire la provetta per circa ¾ con il campione. Pulire l’esterno della cuvetta di nuovo, per garantire che sia pulito e privo di impronte digitali.
Posizionare la cuvetta nello spettrofotometro nell’orientamento corretto, e fissare il coperchio.
Raccogliere una misura di assorbanza o spettro alla stessa lunghezza d’onda o gamma di lunghezza d’onda come il bianco. Sottrarre lo spettro o la misurazione del bianco, se lo strumento non lo fa automaticamente.
Dallo spettro di assorbanza raccolto, determinare l’assorbanza massima, o λmax.
Per quantificare la quantità di analita nel campione, creare una curva di calibrazione utilizzando una gamma di concentrazioni note di analita. Per maggiori informazioni su come costruire e usare una curva di calibrazione, guarda il video di questa collezione “Calibration Curves”.
La misura dell’assorbanza può anche essere usata per calcolare la cinetica di reazione misurando l’aumento o la diminuzione della concentrazione di un composto durante la reazione. Iniziare prendendo una lettura iniziale del campione, il colorante blu in questo caso, al massimo dell’assorbanza prima della reazione.
Poi, aggiungere rapidamente il reagente, la candeggina in questo caso, per iniziare la reazione chimica. Mescolate bene, in modo che si mescoli al campione.
Misurate l’assorbanza al massimo dell’assorbanza nel tempo.
Lo spettro di assorbanza iniziale del campione di colorante blu è mostrato. I colori di sfondo mostrano i colori della luce nello spettro visibile. Il colorante blu ha un’assorbanza massima a circa 630 nm.
La cinetica della reazione tra il colorante blu e la candeggina è stata misurata nel tempo. L’assorbanza del colorante blu diminuisce nel tempo, mentre reagisce con la candeggina. L’assorbanza raggiunge quasi lo zero dopo 300 s, indicando che la reazione è vicina al completamento. Per maggiori informazioni sulla cinetica e le reazioni, guarda il video JoVE Science Education “Reaction Rate Laws”.
La spettroscopia UV-Vis è molto usata in molte aree di ricerca diverse per identificare o quantificare un campione.
Per esempio, la spettroscopia UV-Vis è molto usata in campo biologico per quantificare la quantità di proteine in un campione. Un saggio Bradford è spesso utilizzato per quantificare le proteine, con l’aiuto di un colorante. In primo luogo, viene preparata una curva di calibrazione di concentrazioni proteiche note, in genere utilizzando sieroalbumina bovina, o BSA. Poi si aggiunge il colorante blu Coomassie a ciascuno degli standard e al campione. L’assorbanza del complesso proteina-tintura viene poi misurata a 595 nm.
In alternativa, le proteine possono essere misurate direttamente dalla loro assorbanza a 280 nm. In questo esempio, la concentrazione delle proteine viene quantificata utilizzando uno spettrofotometro a bassissimo volume. Per molte proteine, un’assorbanza di 1 corrisponde a una concentrazione di 1 mg/mL.
La spettroscopia UV-Vis è usata anche per quantificare la quantità di cellule batteriche in una coltura cellulare. Per questa misurazione, l’assorbanza, o densità ottica, viene misurata a 600 nm. In genere, una misurazione OD600 di 1 indica la presenza di 8 x 108 cellule batteriche per mL. Misurare la densità cellulare durante la crescita della coltura permette di determinare la curva di crescita batterica e può aiutare a identificare quando una coltura è nella sua fase di crescita esponenziale.
L’ossido di azoto e il diossido di azoto, o NOx, è un sottoprodotto dei gas di scarico delle automobili e può essere dannoso per l’ambiente perché forma un ozono troposferico dannoso. NOx può essere misurato facendolo reagire con una soluzione di acido solfanilico e naftil-etilendiammina. La soluzione risultante è una molecola di colorante azoico rosa, la cui intensità è direttamente correlata alla concentrazione di NOx. Questa concentrazione può quindi essere determinata utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis.
Hai appena visto l’introduzione di JoVE alla spettroscopia UV-visibile. Ora dovresti capire le basi del funzionamento dell’UV-Vis, come misurare un campione usando un UV-Vis e come correlare l’assorbanza alla concentrazione del campione.
Grazie per aver guardato!