Western blot

Western Blot (WB) è un metodo comune per rilevare e analizzare le proteine. Si basa su una tecnica che prevede il trasferimento, detto anche blotting, di proteine separate per elettroforesi dal gel a una membrana dove possono essere visualizzate in modo specifico. La procedura è stata descritta per la prima volta da H. Towbin et al nel 1979 (Towbin, Staehelin, & Gordon, 1979) e due anni dopo ha ricevuto il suo nome da W. Neal Burnette (Burnette, 1981). Towbin et al hanno descritto il trasferimento elettroforetico di proteine da gel di poliacrilammide a fogli di nitrocellulosa dove il modello originale del gel è stato accuratamente ottenuto. Il setup consiste in una serie standard di sette passi, Figura 1.

Figura 1. Le fasi standard del Western Blotting.

I campioni vengono preparati e caricati su un gel e durante l’elettroforesi le proteine caricate negativamente si muovono verso l’anodo caricato positivamente. Per analizzare ulteriormente le proteine, queste vengono trasferite su una membrana in una procedura chiamata blotting. Dopo il trasferimento, la membrana viene bloccata per evitare interazioni indesiderate tra membrana e proteine nelle fasi successive. Per visualizzare la proteina di interesse, la membrana viene comunemente sondata prima con un anticorpo primario specifico per la proteina, seguito da un anticorpo secondario etichettato usato per la rilevazione. Viene scattata un’immagine della membrana e il risultato viene analizzato.

Aggiungendo una soluzione marker separata a uno dei pozzetti del gel, è possibile stimare la dimensione della proteina oltre alle interazioni anticorpali che vengono utilizzate per verificare la proteina specifica. La separazione sul gel non è solo dovuta alla dimensione ma anche, in una certa misura, alla carica molecolare, alle regioni idrofobiche e al grado di denaturazione. L’impostazione dell’esperimento può essere variata in molti modi per adattarsi al meglio all’indagine specifica. Quando si analizzano i risultati, si devono prendere in considerazione le variazioni tra le corsie per quanto riguarda i tassi di carico e di trasferimento tra i blot. Inoltre, la relazione non lineare del segnale generato attraverso l’intervallo di concentrazione dei campioni è anche un aspetto da considerare quando si interpretano i risultati. Il risultato di un esperimento WB dipende da tre importanti fattori: la capacità dell’anticorpo di legare una specifica proteina, la forza dell’interazione e la concentrazione della proteina di interesse stessa. Inoltre, anche la specificità del legame al bersaglio e una bassa reattività incrociata sono caratteristiche importanti. Il risultato del WB non è sempre facile da interpretare in quanto la dimensione della proteina può variare dal peso teorico a causa di modifiche post-traslazionali, come la glicosilazione, o interazioni con altre proteine. Tuttavia, il WB è un metodo molto comune e quasi tutti gli anticorpi commerciali disponibili sono stati convalidati utilizzando questo metodo.

Tecnologia

Preparazione del campione

Il primo passo di un WB è quello di preparare il campione, ad esempio tessuto, cellule o altra soluzione, che sta per essere analizzato. Di solito il tessuto deve essere frantumato mediante miscelazione, omogeneizzazione o sonicazione. Vengono aggiunti tamponi per lisare le cellule e solubilizzare le proteine e spesso viene aggiunto un inibitore per prevenire la denaturazione o la degradazione. Vengono applicati diversi tipi di metodi di filtrazione e centrifugazione per preparare ulteriormente i campioni. È importante determinare la concentrazione proteica totale dell’estratto generato per essere in grado di caricare una quantità specifica sul gel per consentire il confronto tra i campioni. Di solito si usa un test biochimico per determinare la concentrazione proteica. L’estratto viene poi diluito con un tampone di carico composto da glicerolo e un colorante (per esempio blu di bromofenolo). Il glicerolo è usato per semplificare il caricamento aumentando la densità dell’estratto e il colorante è aggiunto per visualizzare il campione. Il calore viene applicato sui campioni al fine di rompere le strutture della proteina, che aiuterà a mantenere la carica negativa dalla neutralizzazione (Mahmood & Yang, 2012). Preferibilmente i controlli positivi e negativi sono inclusi nel set up per confermare l’identità della proteina così come l’attività dell’anticorpo.

Elettroforesi su gel

Dopo la preparazione del campione l’estratto è pronto per essere caricato per separare le proteine secondo le dimensioni mediante elettroforesi su gel. Viene applicato un campo elettrico sul gel che fa muovere le molecole cariche. Nel WB i gel di poliacrilammide sono utilizzati per la separazione delle proteine e il metodo è quindi chiamato elettroforesi su gel di poliacrilammide (PAGE) quando si utilizzano condizioni native. Per le condizioni denaturanti, viene aggiunto al sistema il sodio dodecil solfato (SDS) e il metodo viene quindi chiamato SDS-PAGE. L’SDS si lega alla proteina e forma una micella caricata negativamente intorno alla proteina indipendentemente dalla carica intrinseca. La condizione di denaturazione dissolve la struttura tridimensionale delle proteine e la carica della proteina diventa relativa alla sua dimensione con conseguente separazione delle proteine solo per dimensione. Quando si usano le condizioni native la mobilità dipende sia dalla carica che dalla dimensione idrodinamica, permettendo di rilevare i cambiamenti di carica dovuti alla degradazione chimica, ai cambiamenti conformazionali dovuti al ripiegamento o allo spiegamento, all’aggregazione o ad altri eventi di legame.

Il gel consiste tipicamente di due sezioni con densità diverse: (i) un gel di impilamento e (ii) un gel di separazione, Figura 2. Le differenze tra le due sezioni sono nel pH e nella concentrazione del gel. Con un pH un po’ acido e una concentrazione più bassa di acrilammide, il gel di impilamento separa poco le proteine, ma permette loro di formare bande nitide altamente definite prima di entrare nel gel di separazione. Con condizioni più basiche e una concentrazione di gel più alta, il gel di separazione fa differenziare le proteine in base alle dimensioni, poiché le proteine più piccole viaggiano più velocemente nel gel rispetto a quelle più grandi. I gel prefabbricati sono convenienti; tuttavia, è possibile fonderli a mano. Il gel viene immerso nel buffer e i campioni di proteine e i marcatori vengono caricati nei pozzetti del gel. Viene applicato un voltaggio sul gel e le proteine inizieranno a viaggiare lungo il gel a causa della loro carica elettrica negativa. Scegliere il voltaggio appropriato è importante poiché un voltaggio troppo alto surriscalderà il gel e forse deformerà le bande.

Figura 2. Un tipico gel immerso nel buffer.

Blotting alla membrana

Dopo l’elettroforesi del gel le proteine sono trasferite su una membrana di supporto solido, che è il terzo passo del Western Blot. Nel processo di trasferimento viene applicata una tensione per trasferire le proteine dal gel alla membrana. Il setup include spugne, carte da filtro, il gel e la membrana, che è posta tra il gel e l’elettrodo positivo, Figura 3. Questo assicura la migrazione delle proteine a carica negativa dal gel alla membrana. Esistono tre tipi di membrane: nitrocellulosa, polivinilidene difluoruro (PVDF) e nylon. Anche se le membrane di nylon sono superiori sotto diversi aspetti, l’elevato legame di fondo e la colorazione irreversibile di alcuni coloranti rendono questo tipo di membrana meno comune rispetto alle altre due alternative. Il vantaggio principale delle membrane in nitrocellulosa è il basso background indipendentemente dal metodo di rilevamento. A causa di una dimensione media dei pori relativamente grande, le membrane di nitrocellulosa non dovrebbero essere utilizzate per il trasferimento di proteine a basso peso molecolare. Inoltre, quando è asciutta, la membrana diventa fragile e ciò la rende difficile da maneggiare. La membrana in PVDF, più stabile, permette la rietichettatura ed è più conveniente da conservare. La natura idrofobica del PVDF si traduce in un’elevata capacità di legare le proteine, tuttavia, come conseguenza, il fondo è anche più alto.

Figura 3. Le proteine nel gel vengono bloccate su una membrana e il campione viene visualizzato attraverso il blocco, l’aggiunta di anticorpi e il lavaggio secondo un certo programma.

Ci sono due metodi per il blotting chiamati wet e semi-dry. Le condizioni umide sono preferite quando il trasferimento deve essere efficiente e dare un’alta qualità per quanto riguarda le bande distinte e nitide. Inoltre, questa è la scelta migliore per il trasferimento di grandi complessi proteici. Il gel, la membrana e la carta da filtro sono completamente immersi nel buffer durante il trasferimento e non c’è il rischio di asciugare il gel. Il blotting semisecco è più rapido ed è necessario un minor volume di buffer. Tuttavia, questo metodo di trasferimento è di solito meno efficiente, specialmente per le proteine più grandi, e c’è il rischio di surriscaldare e asciugare il gel quando si usano tempi di trasferimento prolungati.

Anticorpo in prova

Il quarto passo del WB è la prova dell’anticorpo. Al fine di prevenire il legame aspecifico degli anticorpi alla membrana, piuttosto che il legame specifico alla proteina di interesse, viene utilizzata una sostanza per bloccare i siti residui sulla membrana. Le sostanze comunemente usate sono il latte secco non grasso, l’albumina di siero bovino (BSA) al 5% diluita in Tris Buffered Saline Tween (TBST), il siero normale di capra, la caseina o la gelatina di pesce (Mahmood & Yang, 2012). Il latte è facile da ottenere e poco costoso, tuttavia non è adatto a tutte le etichette di rilevamento. Gelatina di pesce dà sfondo inferiore, ma può mascherare alcune proteine, oltre ad essere un tampone di bloccaggio relativamente costoso. La BSA è poco costosa, mentre il siero può contenere immunoglobuline che danno luogo a reattività incrociata. Un’attenta selezione dell’agente bloccante è fondamentale poiché nessuno dei tamponi bloccanti è ideale per tutte le diverse interazioni antigene-anticorpo. La procedura di blocco consiste nell’incubare la membrana nel tampone di blocco appropriato per un’ora o più. Quando si utilizzano tempi di incubazione lunghi, il blocco dovrebbe essere eseguito a +4°C per escludere il rischio di artefatti di colorazione o di sfondo. Il blocco è un delicato equilibrio tra la riduzione dello sfondo senza diminuire il segnale della proteina di interesse.

La membrana bloccata viene quindi incubata con l’anticorpo primario. L’anticorpo viene diluito ad una concentrazione adeguata in TBST, tampone fosfato (PBS) o tampone di lavaggio. È preferibile incubare l’anticorpo con BSA se l’anticorpo deve essere riutilizzato. Dopo aver lavato la membrana, la membrana viene incubata con l’anticorpo secondario che si lega all’anticorpo primario. L’anticorpo secondario è etichettato con un reporter. Quando si usa un anticorpo policlonale come anticorpo secondario, può dare origine a un certo background. In caso di colorazione di fondo, l’anticorpo secondario può essere pre-bloccato con siero non immune dall’ospite in cui è stato generato. L’ottimizzazione della concentrazione dell’anticorpo secondario è raccomandata a causa delle variazioni abbastanza estese tra gli anticorpi così come il sistema di rilevazione utilizzato.

Rilevazione

Nella quinta fase di un WB, il complesso proteina-anticorpo-anticorpo viene rilevato sulla membrana. Ci sono diversi tipi di etichettatura dell’anticorpo secondario, ad esempio enzimi, fluorofori, biotinilazione, coniugazione con oro e radioisotopi, come esemplificato nella Figura 4. Tra gli enzimi il più comune è HRP usato insieme a sostanze chemiluminescenti, chemifluorescenti o cromogene. L’HRP ha un’alta specificità di substrato che dà un basso background, è stabile e poco costoso. Nella chemiluminescenza l’enzima HRP catalizza l’ossidazione del luminolo dal reagente di rilevamento del perossido di luminolo. La reazione a più fasi genera l’emissione di luce. Alcune sostanze chimiche come i fenoli possono aumentare la luce emessa. Un metodo diretto è l’uso della fluorescenza; i fluorofori emettono luce dopo essere stati eccitati e non è necessario alcun agente di rilevamento. È molto adatto per il Western quantitativo e poiché diversi fluorofori emettono luce di diverse lunghezze d’onda, è possibile eseguire il multiplexing e la rilevazione specifica di più di una proteina alla volta. L’utilizzo di una sostanza chimica e/o di un enzima per indurre la generazione di un fluoroforo attivo da un substrato fluorogenico è chiamato chemifluorescenza. Per aumentare ulteriormente l’intensità del segnale può essere usato un sistema a due fasi basato sulla streptavidina della biotina. Anche la coniugazione dell’oro è un metodo in cui le proteine si colorano di rosso scuro a causa dell’accumulo di oro. È anche possibile usare i radioisotopi, ma richiedono una gestione speciale e sono abbastanza costosi.

Figura 4. Diversi sistemi di reporter.

Imaging

Imaging è il sesto passo del WB e la cattura può essere analogica utilizzando una pellicola, o digitale con una telecamera CCD o uno scanner che cattura i diversi tipi di segnali emessi. Il dispositivo di imaging CCD permette la quantificazione con un’alta sensibilità di rilevamento e un’ampia gamma lineare senza sprechi chimici o necessità di una camera oscura. Può essere usato per rilevare membrane, gel colorati, o per applicazioni con luce ultravioletta.

Analisi

L’ultimo passo di un WB è l’analisi dei risultati. In una tipica applicazione qualitativa, la presenza di una proteina di interesse è confermata, la quantità è approssimata dall’ispezione visiva e la dimensione è determinata dal confronto con un marcatore. I miglioramenti e gli sviluppi, specialmente verso reagenti di rilevamento altamente sensibili e tecniche di imaging avanzate, rendono il WB uno strumento potenziale per l’analisi quantitativa. Le applicazioni quantitative comportano una definizione della quantità di proteine in termini relativi o assoluti. Alcuni fattori sono da prendere in considerazione come la sensibilità, la stabilità del segnale, la gamma dinamica lineare, la normalizzazione e il rapporto segnale-rumore. Il minimo di proteina che può essere visto in un dato test dà il limite di rilevazione (LOD), e il limite di intensità del segnale che può essere usato in modo affidabile per una quantificazione precisa è il limite di quantificazione (LOQ). I fattori che influenzano questi termini sono la qualità e le concentrazioni degli anticorpi e i tempi di esposizione quando si considera la quantità minima di proteina rilevata. Un sistema di segnale stabile espande la finestra temporale per raggiungere un’alta sensibilità, esposizioni multiple e la possibilità di rilevare bande deboli. L’intervallo che permette una quantificazione uniforme e precisa in cui l’intensità del segnale è ancora proporzionale alla quantità di proteine è chiamato intervallo dinamico lineare. È importante evitare la saturazione del segnale dovuta a quantità eccessive di proteine o ad alte concentrazioni di anticorpi. Un LOD basso e la quantificazione di segnali sia deboli che forti danno un ampio range dinamico lineare. La proteina di interesse dovrebbe essere normalizzata ad un riferimento interno che permette fluttuazioni nella quantità di proteina caricata su ogni pozzetto o concentrazioni diverse. Questo può essere ottenuto con proteine housekeeping o spiked. Il rapporto tra il segnale e il rumore è importante per quantificare correttamente la proteina. Questo è di estrema importanza quando si rilevano bande deboli dove ci si aspetta uno sfondo più alto.

Esempi specifici

Anche se il peso teorico di molte proteine differisce dal peso reale a causa delle modifiche post-traduzionali, quasi tutti gli anticorpi commerciali sono validati usando il WB.

Nel progetto Human Protein Atlas il WB è usato per il controllo qualità degli anticorpi policlonali generati nel progetto. Dopo la purificazione, gli anticorpi sono usati per rilevare le bande in un setup di lisato e in diversi tessuti. L’uso di siRNA WB è attualmente implementato per analizzare ulteriormente gli anticorpi.

L’intero protocollo WB, compresa la diluizione degli anticorpi primari e secondari e la fase finale di rilevazione, viene eseguito in modo routinario e non viene fatta alcuna ottimizzazione sperimentale specifica per i singoli anticorpi. All’inizio, lisati proteici totali da linee cellulari e tessuti selezionati (15?g di RT-4, U-251MG, fegato e tonsille, nonché 25?g di HSA- e IgG-depleted plasma) e un marcatore (PageRuler Plus Prestained Protein Ladder; Thermo Scientific) sono caricati su prefabbricati 4-20% Criterion SDS-PAGE gradiente gel (Bio-Rad Laboratories) ed eseguito in condizioni di riduzione, seguita da trasferimento a membrane PVDF (Bio- Rad Laboratories) utilizzando Trans-Blot turbo (Bio-Rad Laboratories) secondo le raccomandazioni del produttore. I gel a gradiente SDS-PAGE Criterion insieme al marker rendono possibile l’analisi delle proteine nelle dimensioni che vanno da 10 a 250 kDa. Le membrane sono poi attivate in metanolo prima del blocco (5% latte secco, 0,5% Tween 20, 1× TBS; 1 mM tris-HCl, 0,15 M NaCl) per 1 ora a temperatura ambiente durante l’agitazione costante. Le membrane sono poi incubate con l’anticorpo primario HPA diluito a ~ 0,6?g/ml, per 1 h, seguita da un lavaggio (1 mM tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05% Tween) e l’incubazione per 45 minuti con l’anticorpo secondario coniugato con perossidasi (suino anti-rabbit 1:4000, Dako). Per gli anticorpi commerciali si usa una diluizione di 1:500 e l’anticorpo secondario è un anti-rabbit suino (1:3000, Dako) o un anti-mouse di capra (1:3000, Dako). Una telecamera CCD (Bio-Rad Laboratories) viene utilizzata per il rilevamento del segnale dal substrato (Immobilon Western Chemiluminescence HRP Substrate; Millipore).

Un tipico Western Blot da HPA si vede nella Figura 5.

Figura 5. Tipico risultato di Western Blot usando HRP e una telecamera CCD.

Riferimenti e link

L’articolo che nomina il metodo e lo descrive più in dettaglio:
Burnette WN&periodo;, “Western blotting”: trasferimento elettroforetico di proteine da gel di sodio dodecil solfato-poliacrilammide a nitrocellulosa non modificata e rilevazione radiografica con anticorpo e proteina A radioiodata. Anal Biochem. (1981)
PubMed: 6266278

L’articolo descrive la tecnica di Western Blotting, la teoria e la risoluzione dei problemi:
Mahmood T et al., Western blot: tecnica, teoria, e risoluzione dei problemi. N Am J Med Sci. (2012)
PubMed: 23050259 DOI: 10.4103/1947-2714.100998

Il primo articolo che descrive il trasferimento elettroforetico di proteine alla membrana:
Towbin H et al, Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. 1979. Biotechnology. (1992)
PubMed: 1422008

Western Blotting Principles and Methods – un manuale gratuito fornito da GE Healthcare:
http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/catalog/en/GELifeSciences-se/service-and-support/handbooks

Western Blotting nel progetto Human Atlas Protein:
Western Blotting

Wikipedia – link rilevanti:
Electroforesi su gel di poliacrilammide

Enciclopedia del Western blot – Un sacco di informazioni utili sul Western blot così come la risoluzione dei problemi, protocolli e selezioni di anticorpi:
http://www.western-blot.us

Antibodypedia – Un database ad accesso aperto di anticorpi pubblicamente disponibili e la loro utilità in varie applicazioni:
http://www.antibodypedia.com

VIDEO: Western blotting passo dopo passo, un tutorial realizzato da Amersham™ ECL™ Prime:
https://www.youtube.com/watch?v=Fozv11nyjzE&feature=relmfu