紫外可視（UV-Vis）分光法は、実験室で最も人気のある分析技術の一つです。
UV-Vis分光法では、紫外または可視スペクトルの特定の波長の光をサンプルに通します。 サンプルが光の一部を吸収している場合、光のすべてが通過するわけではなく、透過します。 透過率は、入射光に対する透過光の強度の比であり、吸光度と相関がある。 吸光度は、定量的には試料の濃度を得るために用いられます。 また、吸光度スペクトルと呼ばれる波長域の吸光度を測定し、公表されているデータと照合することで、化合物の同定を行うといった定性的な利用も可能です。
光子が分子に当たって吸収されると、その分子は基底状態からより高いエネルギー状態へと昇格します。 このときのエネルギー差がバンドギャップです。 光子が吸収されるためには、光子のエネルギーがバンドギャップと正確に一致する必要があります。
吸光率は、「吸光率＝モル減衰係数×光路長＋濃度」というビールの法則に従う。 モル減衰係数は、特定の波長の光を吸収する個々の化合物の能力に関係します。 光路長とは、光がサンプルを通過する距離のことで、標準的なキュベットでは通常1cmである。
UV-Visは一般的な手法と呼ばれており、ほとんどの分子がUV-可視波長領域の光を吸収するからです。 紫外域は100〜400nm、可視域は400〜700nmの範囲にあります。 しかし、ほとんどの分光光度計は、100～200 nmの深紫外領域の光源が高価であるため、この領域では動作しない。
紫外可視分光光度計の多くは、紫外域に重水素ランプ（170～375nm）、可視域にタングステンフィラメントランプ（350～2500nm）を使用しています。 モノクロメーターとは、光の波長を空間的に分離し、目的の波長の光があるところに出射スリットを置く装置のことです。 モノクロメーターは、光の波長を空間的に分離する装置で、目的の波長の場所に出射スリットを設置します。
UV-Vis分光法の基本がわかったところで、実験室での簡単なUV-Vis実験を見てみましょう。
測定を始める前に、分光光度計の電源を入れ、ランプを安定させるために適切な時間ウォームアップを行います。
きれいなキュベットにサンプル溶媒を入れてブランクを準備し、外側をリントフリーペーパーで拭いて指紋を取り除きます。
キュベットの溝のある面がビームパスから外れていることを確認し、分光光度計に挿入します。
ブランクの吸光度を1つの波長、または複数の波長範囲で測定します。
次に、ブランクを捨て、サンプルでキュベットを2回すすぎます。
次に、ブランクを捨て、サンプルでキュベットを2回すすぎます。そして、キュベットの約3/4をサンプルで満たします。
キュベットの外側をもう一度拭いて、清潔で指紋がないことを確認します。
キュベットを分光光度計に正しい向きで置き、蓋を固定します。
ブランクと同じ波長または波長範囲で吸光度測定またはスペクトルを収集します。
収集した吸光度スペクトルから、吸光度の最大値（λmax）を求めます。
サンプル中の分析物の量を定量するために、既知の分析物の濃度範囲を使用して検量線を作成します。
吸光度測定は、反応中の化合物濃度の増減を測定することで、反応速度の計算にも使用できます。
まず、サンプル（この例では青色染料）の反応前の吸光度の最大値を読み取ります。
次に、化学反応を開始するために、試薬（この例では漂白剤）をすばやく加えます。
経時的に吸光度の最大値を測定します。
青色染料サンプルの初期の吸光度スペクトルを示します。 背景色は、可視スペクトルの光の色を示しています。
青色染料と漂白剤の反応の速度を経時的に測定した。 青色染料の吸光度は漂白剤との反応によって時間とともに減少していきます。 300秒後に吸光度はほぼゼロになり，反応がほぼ完了したことがわかる。
UV-Vis分光法は、様々な研究分野において、サンプルの識別や定量化に多用されています。 また、タンパク質の定量には、色素を用いたブラッドフォードアッセイがよく用いられます。 まず、牛血清アルブミン（BSA）を用いて、既知のタンパク質濃度の検量線を作成します。 次に、クーマシーブルーの染色液を、それぞれの標準試料とサンプルに加えます。
別の方法として、280nmでの吸光度でタンパク質を直接測定することもできます。 この例では、超微量分光光度計を用いてタンパク質の濃度を測定します。
UV-Vis分光法は、細胞培養中のバクテリア細胞の量を定量化するためにも使用されます。
UV-Vis分光法は、細胞培養中の細菌の量を定量するためにも使われます。 一般的に、OD600の測定値が1の場合、1mLあたり8×108個の細菌細胞が存在することを示します。
酸化窒素や二酸化窒素（NOx）は、自動車の排気ガスの副産物であり、対流圏のオゾンを形成するため、環境に悪影響を及ぼす可能性があります。 NOxは、スルファニル酸とナフチルエチレンジアミンの溶液と反応させることで測定できます。 得られた溶液はピンク色のアゾ染料分子で、その強度はNOxの濃度と直接相関している。
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ご視聴ありがとうございました！
UV-Vis操作の基本、UV-Visを使用してサンプルを測定する方法、吸光度とサンプル濃度の相関関係について理解していただけたと思います。