Abstract
背景。 以前、我々は抗セントロメア抗体が陽性の女性は、卵子の成熟と胚の開裂の可能性が損なわれていることを発見したが、この現象の背後にある可能なメカニズムはまだ不明であった。 目的 そこで本研究では、ACAが生きている胚に浸透し、その発生能力を損なうかどうかを、マウス胚とのin vitro共培養によって予備的に調べることを目的とした。 方法は以下の通り。 マウス胚を採取し、ポリクローナルアンチセントロメアタンパクA（CENP-A）抗体を用いて体外培養を行った。その後、免疫蛍光法を用いて抗体の胚への浸透を調べ、胚の発育能を観察した。 結果は以下の通り。 抗CENP-A抗体を添加して培養した胚はすべて核上に免疫蛍光を示したが、対照群の胚はいずれも免疫蛍光を示さなかった。 さらに、抗CENP-A抗体を用いて培養した胚は、対照群に比べて著しい成長障害が見られた。 結論 マウス胚は，着床前のin vitroにおいてACAの直接的な標的となる可能性がある。
1. はじめに
最近の研究で、末梢血に抗セントロメア抗体(ACA)が陽性の女性では、卵子の成熟と初期胚の発生に障害があることが明らかになりました。 さらに最近では、ACA陽性の女性はACA陰性の女性に比べて成熟卵子の割合と胚切断率が有意に低いことが判明し、ACAが女性の生殖能力に影響を与える可能性がさらに明らかになりました。 ACAは、ANAのメンバーの一つとして知られています。 ACAは、1980年に、石灰沈着症、レイノー現象、食道運動障害、強直症、毛細血管拡張症（CREST）症候群の患者の血清中に、セントロメアに対する特異的な抗体として発見されました。 現在、ACAは、全身性硬化症（SSc）の有効な補助診断マーカーとして認識されています。 報告されているように、女性のSSc患者は、自然流産率の上昇、早産、小さな赤ちゃん、不妊など、いくつかの異なる妊娠の悪影響を受けやすいと言われています。 さらに、SSc患者の不妊率は高く、不妊治療の成功率は比較的低いため、さらなる調査が必要です。
1990年代には、マウスの卵子にACAをマイクロインジェクションする試みが行われ、染色体の移動と分離の障害が発生しました。
1990年には、マウスの卵にACAのマイクロインジェクションが試みられ、染色体の移動と分離に障害が生じた。 また、キネトコアは、有糸分裂や減数分裂などの細胞の重要な活動のための動的な構造でもあります。
セントロメアは、DNAとタンパク質の複合体であり、セントロメア・クロマチンとそれに関連するタンパク質複合体によって組み立てられています。 セントロメアタンパクA（CENP-A）は、比較的明確な生物学的機能を持つ構成的セントロメアタンパクの一つであり、主に研究されてきた。CENP-Aは、セントロメアの組み立てと機能実装に重要な役割を果たしていることが繰り返し確認されている。 さらに、CENP-Bと同様に、CENP-AはACAの主要な標的抗原であると考えられています。
ACAは、卵子の成熟と胚の切断の異常に最も密接に関連するANAの一つではないかと推測されました。
2.材料と方法
2.1. マウス胚
交配したICRマウスに妊娠雌馬血清ゴナドトロフィン（10IU腹腔内）およびヒト絨毛性ゴナドトロフィン（10IU i.p.48時間後）で刺激して過排卵を誘発し、ICR雄マウスと交配した。 雌マウスは交配の24時間後に殺した。 卵管を鋭く切断して初期胚を採取し，実験に用いた。 Sun Yat-Sen UniversityのFirst Affiliated Hospitalの倫理委員会がこの研究を承認した。
2.2. In Vitro Embryo Culture
胚はQuinn’s serial medium (Sage, USA)で培養した。 抗体群には、マウスCENP-Aに対するウサギポリクローナル抗体（ウシ血清アルブミン、アジドフリー、英国Abcam社のカスタマイズ製品）を培地に添加した。 培地中の抗体濃度は35μg/mLとした（文献を参考に修正）。 リン酸緩衝生理食塩水（PBS）群（コントロール）は，抗体溶液と同量のPBS溶液（PBS tablet, Millipore, Merck, Germany）を培地に添加した。 ブランクコントロール群は、何も添加していない培地で構成した。
2.3. 免疫蛍光測定
培養2日目および3日目に、3群の各ディッシュから3〜5個の胚を採取し、共培養後の胚に抗CENP-A抗体のシグナルが存在するかどうかを検出するために、免疫蛍光測定を行った。 免疫蛍光アッセイの手順は以下の通りである。 胚を4％ポリオキシメチレンで固定し，0.5％Triton X-100（Sigma, USA）で浸透させた後，5％正常ロバ血清（Jackson Immunoresearch, USA）で封入した。 その後，488標識ロバ抗ウサギIgG（Invitrogen, UK, 1 : 1000希釈）で1時間インキュベートし，水洗後，1μg /mLのDAPI（4,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride, Cell Signaling Technology, USA）で15分間インキュベートし，再び水洗後，ディッシュに固定してその後の顕微鏡観察に供した。 なお，実験群の偽陽性を排除するために，抗体群の胚は，488標識ドンキー抗ウサギIgGの代わりにPBSを用いてインキュベートした（対照の抗体群）
2.4.
2.4.培養した胚の発育（胚毒性試験）
胚毒性試験のための胚の収集と培養は、胚が3日間ずっと皿の中に留まっていたことを除いて、前述と同様に行った。 各グループの胚は、3日目と5日目（1日目は卵子採取日）に発育段階を調べました。 3日目には6〜8セル、5日目には胚盤胞、モルーラ、2〜8セル、無月経の各ステージを記録しました
2.5. 統計解析
統計解析はSPSS 13（SPSS, IL, USA）を用いて行った。 質的データの比較には、カイ二乗検定とカイ二乗の分割検定を用いた。 3群間のカイ二乗検定では0.05未満の値を統計的に有意とし、群間のカイ二乗検定の分割では0.0167未満の値を統計的に有意とした。
3.結果
3.1. 免疫蛍光
抗CENP-A抗体を用いて培養したすべての胚は、その核に強い免疫蛍光を示したが、PBS群とブランクコントロール群、およびコントロール用の抗体群の胚は、いずれも免疫蛍光を示さなかった（図1）。
3.2. Embryotoxicity Assay
PBS群、ブランクコントロール群と比較して、抗体群では、3日目の6～8細胞期の胚、5日目のblastulaおよびmorula期の胚の割合が有意に低かった。 胚の発生ポテンシャルはPBS群とブランクコントロール群で同等であった（表1）。
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| 1日目とは、胚を採取した日のことを指す。 は、3つのグループ間で統計的に有意であると考えられました。a対抗体とPBSグループ、b対抗体とブランクコントロールグループ。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||
4. 考察
1999年、研究者らは、精製した抗核IgGを培養したすべてのマウス胚が、対照の免疫グロブリンを培養したものと比較して、胚細胞に強い免疫蛍光を示し、著しい成長障害や死を経験することを発見した。 これは、ANAがin vitroで胚に直接結合できることを示している。 しかし、帯状体には核抗原やリン脂質が認められなかったため、正確なエピトープは不明であった。 マウスの2細胞期胚では、一連の核タンパク質が一過性に合成され、胚のクロマチン組成が変化していることから、初期胚がANAのエピトープを持っている可能性が示唆された。 さらに、この結合は比較的特異的で、抗甲状腺抗体や健常者の抗体では、胚との結合が認められない。 また、ACAを含む血清をマウス卵母細胞にマイクロインジェクションすると、染色体回帰が阻害され、間期の減数分裂停止や前中期の有糸分裂停止を引き起こす可能性があります。
本研究では、ポリクローナル抗CENP-A抗体を用いて培養したすべての胚が、核成分に対する抗体（抗CENP-A抗体と推測される）の強い免疫蛍光を示し、明らかな胚の成長障害を経験したことから、マウス胚は着床前の試験管内でいくつかのACAの直接の標的となる可能性があることが示された。 また、共培養した胚の大部分は、常に1つまたは一部の胚盤胞のみが蛍光を示した。 おそらく、セントロメアとその周辺にある構造物の密度が抗CENP-A抗体のアクセスを妨げているか、あるいは、蛍光が検出された胚盤はアポトーシスに傾いていて、比較的緩い構造を示していたために抗CENP-A抗体のアクセスが可能だったのではないかと考えられる。
抗体が生きた細胞に入るという明確な概念はなく、そのメカニズムもまだ不明であるが、今回の研究で抗体が生きた細胞に入るという証拠が得られた。 例えば、抗リボヌクレオプロテイン-IgGはTリンパ球に選択的に入ることができたが、Tリンパ球の表面に存在するFcレセプターは比較的少なかった。 つまり、リボ核酸タンパク質抗体は、細胞表面のリボ核酸タンパク質抗原と相互作用して、生きた細胞へのアクセスを制御していることを示唆しているのです。
また、本研究では、抗CENP-A抗体を用いて培養すると、胚の発生能が著しく損なわれ、3日目には6〜8細胞期の胚の割合が、5日目には胚盤胞期の胚の割合が有意に低下することがわかりました。 実際、以前の研究では、ANA陽性血清から精製したIgGを用いて培養したマウス胚は、胚発生能が著しく低下することが判明している。 ANAは、対応する抗原を含む細胞内構造に侵入し、重要な機能領域のエピトープを識別して結合することができる。 これらの自己抗体は、in vivoおよびin vitroの両方で、抗原の機能を著しく阻害する可能性があります。
結論として、抗CENP-A抗体で培養された胚は、著しい成長障害または死を経験しました。
倫理承認
Sun Yat-sen UniversityのThe First Affiliated HospitalのMedical Ethics Committeeが本研究を承認しました(no.75)。
利益相反
Ying Ying、Xi Guo、Yiping Zhong、Canquan Zhouは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
本研究は，中国国家自然科学基金（no.81701518），広州科学技術・情報局（no. 2014J4100161），広東省科学&技術プロジェクト（no.2013B021800271），広東省人口・家族計画委員会（no.20132048）の支援を受けました。 本研究は，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen Universityから，Key Laboratory for Reproductive Medicine of Guangdong Provinceの支援を受けました。 また，本研究は，広州医科大学第三附属病院の「広東省産科疾患重点研究室」および「広東省高等教育機関生殖遺伝重点研究室」の2つの重点研究室の支援を受けました。